第四章抗體工程修改后

抗體工程第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理一、雜交瘤技術(shù)二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存第二節(jié)單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產(chǎn)生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性第三節(jié)基因工程抗體制備一、人源化抗體二、小分子抗體三、抗體融合蛋白四、雙特異性抗體五、噬菌體抗體庫技術(shù)第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用一、檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑二、蛋白質(zhì)的提純?nèi)?、小分子抗體的應(yīng)用四、抗體融合蛋白的應(yīng)用五、雙特異抗體的應(yīng)用六、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景思考題小結(jié)第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長雜交瘤細(xì)胞：壽命長，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術(shù)不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫小鼠。淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞發(fā)育。漿細(xì)胞。抗原接種培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾細(xì)胞的制備：1×108的淋巴細(xì)胞無菌手術(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化。飼養(yǎng)細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3)50%PEG1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;長命脾細(xì)胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細(xì)胞有限稀釋法效率最高價格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過度生長防止細(xì)胞密度過高而死亡細(xì)胞冷凍的意義

第二節(jié)單克隆抗體的制備經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法前5天進(jìn)行,預(yù)先腹腔注射pristane（1～5）×106細(xì)胞1～3w形成腹水高滴度腹水可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細(xì)胞）二、 單克隆抗體的純化ELISAELISA多頭加樣槍。免疫熒光法鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性優(yōu)點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療（二）單克隆抗體的優(yōu)點與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時費(fèi)工、價格較高

McAbPcAb抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低

穩(wěn)定低高沉淀反應(yīng)無有成本高低McAb與PcAb的比較McAbandPcAb第三節(jié)基因工程抗體制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。AntibodyIgGstructureCLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcVHVLCLCH1CH2CH3VHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體方法：從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力（一）嵌合抗體嵌合抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療（二）改型抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

二、小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。四、雙特異性抗體分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳?；瘜W(xué)交聯(lián)BsAb將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時費(fèi)力，臨床應(yīng)用時存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng)(HAMA)，因此不適用于臨床。細(xì)胞工程BsAb多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb?；蚬こ藼sAb定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體