基因突變的篩選與鑒定完整版

1基因突變的篩選與鑒定

基因突變研究首先面臨的問題就是如何收集到特定類型的突變體。遺傳學(xué)家采用兩種辦法解決這個問題：一是設(shè)計(jì)特定的選擇系統(tǒng)（selectivesystem）從群體中檢出理想的突變型；二是利用誘變劑（mutagen）增加突變發(fā)生頻率。2一、微生物基因突變的篩選與鑒定◆選擇培養(yǎng)法（selectiveculture）

根據(jù)野生型與突變型在不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件中的生長能力差異來篩選突變型；也是微生物遺傳重組研究中鑒定重組型的基本方法。3生化突變及相關(guān)概念◆生化突變：◆野生型(wildtype)與原養(yǎng)型(prototroph)★野生型★原養(yǎng)型◆營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)：最低營養(yǎng)素如：Lys+和Lys-41.紅色面包霉生化突變的鑒定方法◆突變的誘發(fā)：◆突變的篩選：

◆突變的鑒定：★

突變的真實(shí)性：★

突變的類型(哪類型營養(yǎng)缺陷型突變？)： 氨基酸？

(加入各種氨基酸)不能生長。 維生素？

(加入各種維生素)能夠生長?！镞M(jìn)一步鑒定具體類型：

硫胺素(VB1)、吡醇素(VB6)、泛酸、肌醇。5紅色面包霉生長突變的誘發(fā)和鑒定完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基10.基本media8：+維生素9：+氨基酸硫胺素一個子囊果基本培養(yǎng)基不生長11完全media一個分生孢子交配n和2n在哪里？一個子囊孢子獲得了什么？吡哆醇泛酸肌醇62.◆野生型紅色面包霉能在基本培養(yǎng)基上正常生長?！魩追N生化突變型：★突變型a：精氨酸 (精氨酸合成缺陷型)；★突變型c：精氨酸或瓜氨酸 (瓜氨酸合成缺陷型)；★突變型o：精氨酸、瓜氨酸或鳥氨酸

(鳥氨酸合成缺陷型)?！艟彼崾潜匦璋被?，合成途徑：73.◆Beadle,G.W.(1941)：基因是通過酶的作用控制性狀表現(xiàn)，提出“一個基因一個酶”假說(如圖所示)。8Beadleinlabcoat.AndEdwardL.Tatum

1958NobelPrize9二、植物基因突變的鑒定

（1）突變真實(shí)性的鑒定◆一致的環(huán)境條件下種植：野生型、突變型◆性狀考察與比較分析(進(jìn)行方差分析)；◆根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定：★兩類個體間沒有差異★差異仍然存在◆分子水平鑒定方法

10（2）突變顯隱性的鑒定隱性突變可利用雜交試驗(yàn)加以鑒定例如：高桿——矮桿：隱性？雜交F1

顯性？11（三）突變率的測定體細(xì)胞突變頻率一般是根據(jù)M2出現(xiàn)的突變體比例估算。例如，在M2群體的10萬個個體數(shù)中出現(xiàn)5個突變體，突變頻率為5×10-5。122.斯特得勒花粉直感13

花粉直感法測定突變(誘變)率玉米籽粒胚乳：非甜(Su)

甜(su)P: 甜粒親本(susu)×非甜粒親本(SuSu)G: su SusuF1: Susu(非甜) susu(甜粒)

正?；ǚ哿：蟠?突變花粉粒后代親本配置：具有花粉直感特征；性狀顯隱性差異明顯；親本具有相對性誘變處理14（四）谷類作物種子誘發(fā)隱性突變鑒定（例）1個分蘗A-a突變植株M1種2種3（1）突變穗（2）2個穗行（3）1個穗行（4）1個穗行（5）其他未突變穗一穗一行目的：獲得隱性突變系，突變率？M1的一個隱性突變，M2、M3的表現(xiàn)如何獲得隱性純系（世代、表型）？AAAAAa15三動物基因突變的篩選與鑒定高等動物基因突變篩選與鑒定面臨與高等植物相似的困難——群體規(guī)模、性狀表現(xiàn)及檢測手段限制。16一個上瞼下垂顯性突變的家系分析第二版？知道突變：何時？顯性17動物基因突變的篩選與鑒定在家系分析上，傳統(tǒng)上強(qiáng)調(diào)“門當(dāng)戶對”和保持王室血統(tǒng)“純潔”的歐洲王室貢獻(xiàn)了最經(jīng)典的分析資料。如X染色體上卟啉代謝基因突變引起的伴性遺傳血友病等。1819重點(diǎn)？中等難度以下繁雜、理解、清楚記住重點(diǎn)，其他理解20第五節(jié)基因突變的分子機(jī)制◆經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：★基因是染色體上的一個點(diǎn)?！衄F(xiàn)代基因概念認(rèn)為：★基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區(qū)段；★座位(site)：bp★位點(diǎn)(locus):gene21DNA損傷（lesion/damage）校正修復(fù)機(jī)制前突變損傷（premutationlesion）修復(fù)差錯22◆根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式：1.堿基替換轉(zhuǎn)換（transition），顛換（transversion）一基因突變的方式231.堿基替換2.缺失突變3.插入突變重復(fù)（repeat）移碼（frameshift）移碼突變：非3bp的倍數(shù)24

分子結(jié)構(gòu)改變：堿基替換和倒位突變方式移碼：堿基的缺失、插入

…GAAGAAGAAGAA…↓

…GGAAGAAGAAGAA…25例：基因突變的類型26“Robinow-Sorauf型尖頭并指(趾畸形)”272829◆1.密碼簡并性CUAUUA都是亮氨酸◆2.回復(fù)突變

◆3.抑制突變基因內(nèi)抑制基因間抑制◆4.二倍體和多倍體◆5.致死和選擇二、突變的防護(hù)機(jī)制核心是防護(hù)！30三DNA修復(fù)與差錯錯配修復(fù)（mismatchrepair）、直接修復(fù)（directrepair）、切除修復(fù)（excisionrepair）、雙鏈斷裂修復(fù)（double-strandbreakrepair）、重組修復(fù)（recombinationrepair）DNA分子結(jié)構(gòu)完整性堿基序列完整性修復(fù)！31（一）錯配修復(fù)（mismatchrepair）：酶修復(fù)系統(tǒng)識別雜種DNA分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)異常的錯配位點(diǎn)。錯配修復(fù)的基本過程為：①修復(fù)系統(tǒng)識別雜種DNA分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)異常的錯配位點(diǎn)。②切除錯誤堿基。③進(jìn)行修復(fù)合成并封閉DNA鏈切口。許多酶參與錯配修復(fù)，如大腸桿菌有MutS、MutL、MutH以及DNA聚合酶、連接酶。32(二)直接修復(fù)：1.光修復(fù)

★

UV照射能引起很多變異：5，6位胸腺嘧啶二聚體(╥)；水合胞嘧啶胞嘧啶氨基對位的那個氮是一號位，羰基的碳是二號位33巡回酶(patrolingenzyme)：如：光激活酶(photoreactingenzyme)藍(lán)色光波光修復(fù)過程34堿基烷基化◆烷化劑？去烷基化（dealkylation）酶烷基轉(zhuǎn)移酶（alkyltransferase）甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltranferase）。2.去烷基化35DNA單鏈斷裂DNA連接酶催化雙螺旋結(jié)構(gòu)中單鏈斷裂處形成磷酸二酯鍵單鏈斷裂只需要在DNA連接酶的作用下就可以直接修復(fù)。3.單鏈斷裂修復(fù)單鏈的的化學(xué)鍵？36◆大腸桿菌中的UVrA突變體的修復(fù)過程由四種酶來完成核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶連接酶暗修復(fù)(darkrepair)，或切除修復(fù)(excisionrepair)。（三）切除修復(fù)：暗修復(fù)37（四）雙鏈斷裂修復(fù)一般只是簡單地通過非同源末端連接過程將兩個斷裂末端拼接。38（五）復(fù)制后修復(fù)帶缺口的單鏈可以通過重組機(jī)制從完整雙鏈獲得修復(fù)所需要的序列信息，其主要步驟如圖所示。重組修復(fù)39◆SOS修復(fù)(SOSrepair)，SOS反應(yīng)是DNA受到損傷或脫氧核糖核酸的復(fù)制受阻時的一種誘導(dǎo)反應(yīng)誘導(dǎo)反應(yīng)。在E.coli

細(xì)胞的DNA合成過程中，這種反應(yīng)由recA-lexA系統(tǒng)調(diào)控。SOS反應(yīng)發(fā)生時，可造成損傷修復(fù)功能的增強(qiáng)。如uvrA、uvrB、uvrC、uvrD、ssb、recA、recN和ruv基因發(fā)達(dá)從而增強(qiáng)切除修復(fù)、復(fù)制后修復(fù)和鏈斷裂修復(fù)。（六）SOS反應(yīng)傾向差錯修復(fù)40自發(fā)突變（spontaneousmutation）第六節(jié)基因突變的誘發(fā)誘變劑41一、物理誘變物理誘變劑：(一)電離輻射誘變◆1.種類：★粒子輻射：α射線、β射線(32P、35S)、中子(60鈷、137銫)；★電磁波輻射：X射線、γ射線?！?.方法：★外照射：中子、X射線、γ射線；★內(nèi)照射：α射線、β射線。423.原理：基因的化學(xué)物質(zhì)(DNA)發(fā)生電離作用◆原發(fā)電離：次級電離：離子對次級電離的結(jié)果，輕則造成基因分子結(jié)構(gòu)的改組，產(chǎn)生突變了的新基因，重則造成染色體的斷裂，引起染色體結(jié)構(gòu)的畸變43◆輻射劑量的表示方法：★

X射線、γ射線：倫琴(R)；★中子：積分流量(n/cm2)；★

β射線：微居里(μcu/g)?！敉蛔兟逝c輻射劑量：★突變率與輻射劑量成正比；★突變率與劑量率(輻射強(qiáng)度)的影響無關(guān)。4.電離輻射誘變的作用規(guī)律44(二)非電離輻射誘變◆物理誘變的非特異性：對DNA分子及其核苷酸殘基無選擇性，所以沒有?；院吞禺愋钥裳浴！?/p>

H2O2◆紫外線的作用機(jī)制：◆激發(fā)作用

原子外圍的電子活躍起來紫外線(UV)特別作用于嘧啶，胸腺嘧啶聯(lián)合成二聚體；胞嘧啶脫氨成尿嘧啶水加到嘧啶的C4、C5位置上成為光產(chǎn)物。它可以削弱C—G之間的氫鍵，45參觀中國科學(xué)院原子

46日本原子能所47二、化學(xué)誘變誘變劑及其種類：◆堿基類似物：◆堿基修飾物：◆DNA插入劑：48(一)堿基類似物◆5–溴尿嘧啶(5BU)，5—溴去氧尿核苷、2—氨基嘌呤等在DNA復(fù)制時引起堿基配對上的差錯☆轉(zhuǎn)換(transition)：☆顛換(transversion：4950◆5–溴尿嘧啶類似胸腺嘧啶5–BUk—-正常的酮式狀態(tài)和腺嘌呤配對(A)。烯醇式結(jié)構(gòu)具有胞嘧啶的氫鍵特性，容易和鳥嘌呤（G）配對。5–溴尿嘧啶51(二)堿基修飾物直接改變DNA某些特定的結(jié)構(gòu)

◆DNA誘變劑亞硝酸、烷化劑和羥胺等。◆亞硝酸氧代替腺膘玲和胞嘧啶C6位置上的氨基，使腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤(H)、胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U）復(fù)制時完成AT→GC，GC→AT的轉(zhuǎn)換。52◆烷化劑甲基磺酸乙酯(EMS)，甲基磺酸甲酯(MMS)、亞硝酸胍等?！敉榛軌蛞频狡渌娮用芏容^高的分子中去，從而改變氫鍵的結(jié)合能力?！锿榛饔米钊菀装l(fā)生在G的N7位置上，形成7–烷基鳥嘌呤。7–烷基鳥嘌呤可與胸腺嘧啶配對，使GC→AT轉(zhuǎn)換6-Cl53★烷化作用使DNA的堿基容易受到水解而從DNA鏈上裂解下來，造成堿基的缺失★烷化劑的另一個作用是與磷酸結(jié)成不穩(wěn)定的磷酸酯，磷酸酯水解成磷酸和脫氧核糖，使DNA鏈斷裂，從而引起突變54(三)堿基插入物：引起DNA復(fù)制的錯誤

某些誘變劑，例如，2氨基吖啶、ICR–170等能嵌入DNA雙鏈中心的堿基之間，引起單一核替酸的缺失或插入。

吖啶555657玉米轉(zhuǎn)座子解離因子（Ds）——染色體的斷裂控制因子（Ac）——可以轉(zhuǎn)座，控制Ds因子轉(zhuǎn)座◆Ds從原來的位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到C基因座位。Ds插入C座位后引起：第一染色體在C位點(diǎn)發(fā)生斷裂；第二C–c的基因突變。這種突變在Ac因子不存在時是穩(wěn)定的，種子糊粉層無色，植株也不產(chǎn)生色素；但在Ac存在時，有些細(xì)胞可以發(fā)生由c–C的回復(fù)突變，所以種子糊粉層和植株都會出現(xiàn)有色斑點(diǎn)玉米中的Ac、Ds及其遺傳特點(diǎn)。58(二)真核生物的轉(zhuǎn)座因子

◆

Ac因子：4563bp，帶有兩個與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因，這兩個酶基因從一個連接它們的共同起點(diǎn)開始，分別向兩個方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在兩個基因未端還有兩個不編碼的序列，最后是由11個核苷酸組成的反向重復(fù)區(qū)。它通過由8個核苷酸組成的靶子位點(diǎn)重復(fù)DNA與受體基因連接起來?！?/p>

Ds因子大小差別很大。Ds9很象Ac，只是缺失3194個核苷酸。而一個最小的Ds因子只有Ac長度的1/10，僅僅包括了Ac因子的未端反向重復(fù)區(qū)(圖10－17)59（二）轉(zhuǎn)座因子的結(jié)構(gòu)特性(一)原核生物的轉(zhuǎn)座因子

1．插入因子

◆插入因子(insertionsequence，IS)是已知具有轉(zhuǎn)座能力最簡單的遺傳因子，長度大都小于2kb，最少的如IS1只用768bp。◆它們的一個共同特征是，在它們的末端都具有一段反向的重復(fù)序列(IR)。但其長度并不一定相等。例如IS10左邊IR序列是17bp，右邊是22bp。60◆是由幾個基因組成的特定的DNA片段，而且往往帶有抗菌素抗性基因，所以易于鑒定。根據(jù)結(jié)構(gòu)特性的不同，分為：★復(fù)合轉(zhuǎn)座子：由2個同樣的IS因子連接抗菌素抗性片段的兩側(cè)構(gòu)成的?！?/p>

Tnp3系轉(zhuǎn)座子：長度約為5000bp。末端有一對3