第六章 酶的化學修飾

第五章酶的化學修飾從廣義上說，凡通過化學基團的引入或除去．而使蛋白質(zhì)共價結構發(fā)生改變，都可稱為蛋白質(zhì)的化學修飾。本章將集中描述肽鏈側鏈基團被化學試劑專一性地修飾．這稱為選擇性化學修飾?，F(xiàn)在已羥開發(fā)了許多根據(jù)顏色、熒光或放射性對肢鏈化學基團進行反應的有效試劑對酶的催化部位或結合部位特異性很高的試劑也相繼出現(xiàn)。這些試劑有時有高度的專一性，只對少數(shù)的或個別的基團進行作用，這使選擇性化學修飾的應用價值大為提高。然而也要注意到蛋白質(zhì)修飾的復雜性。對小肪能作用的試劑，有時對蛋白質(zhì)并沒有影響。蛋白質(zhì)被修飾后，它的構象相應地發(fā)生變化，并且有時會導致蛋白質(zhì)生物活性的喪失。

本章著重敘述蛋白質(zhì)化學修飾的原理、方法和應用，介紹蛋白質(zhì)化學修飾的現(xiàn)狀及進展。概述第一節(jié)化學修飾的原理一、影響酶蛋白功能基反應性的因素:用x射線衍射分析蛋白質(zhì)所得到的數(shù)據(jù)清楚地證明。多數(shù)非極性側鏈(疏水側鏈)位于非常致密的分子基體的中心，而多數(shù)極性帶電側鏈(親水側鏈)位于基體的表面。分子表面在外形上并不規(guī)則，極性也很不相同。蛋白質(zhì)功能基所處的環(huán)境強烈地影響著它的物理和化學性質(zhì)。蛋白質(zhì)分子的表面特點也影響化學試劑的接近。因此，有必要考查局部微區(qū)對功能基和修飾劑的影響。由于功能基的反應性是通過它的親核性來測量的，而親核性又常常(但不總是)與它的酸堿性有關，因此．應當強調(diào)pK和影響pK的因素。影響蛋白質(zhì)化學修飾反應進程的因素主要有兩個：一是蛋白質(zhì)功能基的反應性；二是修飾劑的反應性?，F(xiàn)分述如下。1．微區(qū)的極性

微區(qū)的極性是決定基團解離狀態(tài)的關鍵因素之一。乙酸的pK(在水中為4.76)在80%乙醇中增至6.87；在l00%乙醇中增至10.32。此例中，乙酸羧基所處微區(qū)的極性直接與介質(zhì)的介電常數(shù)有關。隨介質(zhì)極性降低，按基的pK升高。卵清溶菌酶中第35號谷氨酸的γ-COOH在25℃時的pKa為5.9，而當溶菌酶與其抑制劑三-N-乙酰氨基葡萄糖結合后，此pKa則升至6.4，pKa的提高可能是由于這個殘基的微區(qū)極性降低之故。從整體來看，局部極性的改變對色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應性的影響最??；對氨基和組氨酸反應性的影響較大；對酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應性影響最大。極性對整個反應速度的影響還與反應的類型有密切關系。

天然蛋白質(zhì)或它的離子通過氫鍵來維持其穩(wěn)定性，也是使pK發(fā)生改變的一個因素。例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。這不是由于空間原因，而是由于氟與酚基形成氫鍵的能力比濱強。水楊酸的羧基可與其酚基形成O—H…O氫鍵，結果使其羧基的pK比正常值小1，同時使酚基的正常pKl0改變到pKl3。因此，在蛋白質(zhì)的酚基—羧基相互作用中，羧基的pK應比正常值低，而酚基的pK高于正常值。2．氫鍵效應3．靜電效應用高分辨率的核磁共振法對組氨酸殘基的電離行為進行的研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨園殘基的pK是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菊核酸兩各有4個組箋酸殘基。碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23葡萄球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6.50

組氨酸殘基在這兩個蛋白質(zhì)中的p久范圍是5.37—7.23的數(shù)據(jù)指出，這些變化可能是由于帶電基團相互影響所致。

上述三點是影響蛋白質(zhì)中可電離氨基酸側鏈的pKa值的重要因素，當然也是影響側鏈基因反應性的重要因素。蛋白質(zhì)中個別功能基所處微區(qū)不同，反應性也不同。個別功能基的反應性只能通過實驗來測定。測定方法

Hart1y等人研制一種競爭標記法，可用來測定蛋白質(zhì)分子中個別基團的反應性。其原理是用痕量放射性試劑標記蛋白質(zhì)分子中不同部位的功能基。被標記的量由功能基的pK及其微區(qū)來決定。然后用酶解法降解蛋白質(zhì)，再將每一個含標記基團的肽分離出來。由它們的比放射性測定其相對于標準物的反應速度。整個過程要在幾個pH下重復進行。根據(jù)相對修飾速度對pH所作的圖，可計算出反應基團的pK值。已用此法測定了豬胰彈性蛋白酶的氨基的反應性。此外，用乙酸酐競爭標記法測定了α-胰凝乳蛋白酶的3個氨基末端的反應性。二、酶蛋白功能基的超反應性功能基的反應性往往通過其親核性來衡量，但并不是用親核性就可以解釋一切，功能基的反應性比較復雜。超反應性就是這種復雜性的表現(xiàn)之一上述影響功能基反應性的因素可歸納為兩個方面：

一是微區(qū)的極性，基團之間的氫鍵及靜電相互作用等因素對功能基pK值的影響

二是基團之間的空間障礙

超反應性指的是蛋白質(zhì)的某個側鏈基團與個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應。多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡單氨基酸中的同樣基團相比，反應性要差。但是，每個蛋白質(zhì)分子中至少有一個基團對一定的試劑顯示出超反應性。酶的催化活性基團通常對修飾劑是有反應性的，但酶的超反應基團不一定是酶活性部位上的基團，可能與酶的功能或構象沒有明顯聯(lián)系。例如，木瓜蛋白酶中的19個酪氨酸殘基中，只有1個能與二異丙基氟磷酸酯反應，修飾后酶活性并不改變。

4．位阻效應處于蛋白質(zhì)表面的功能基，一般說來比較容易與修飾劑反應。但是，如果烷基在空間上緊靠功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，這時就要出現(xiàn)位阻效應。對枯草桿菌蛋白酶BPN’的x射線衍射研究指出，它的所有的10個酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面。而且苯酚的羧基幾乎在所有情況下都沒有形成氫鍵。但是，如果對它進行徹底硝化和碘化后，10個酪氨酸中只有8個被修飾。若沒有x射線衍射研究結果，很可能解釋為至少有2個酪氨酸殘基被包埋在分子內(nèi)部，但實際情況并不是這樣。這種情況很可能是空間障礙引起的。還有幾種因素也能改變蛋白質(zhì)功能基的反應性，如電荷轉移，共價鍵形成，金屬螯合旋轉自由度等。但由于可供利用的資料有限．這里不作敘述，第二節(jié)化學修飾的方法學著手蛋白質(zhì)修飾工作時，首先碰到的是修飾試劑和修飾條件的選擇，以期提高修飾反應的專一性，獲得滿意的修飾結果。修飾反應進行過程中要建立適當?shù)姆椒▽Ψ磻M程進行追蹤，獲得一系列有關修飾反應的數(shù)據(jù)。最后對得到的數(shù)據(jù)進行分析，確定修飾部位和修飾程度，提出對修飾結果的合理解釋。一、修飾反應專一性的控制如果對與催化活性、底物結合或構象維持有關的功能基一無所知，那就只有通過反復試驗去了解。在這樣探索性的研究中，修飾劑及修飾反應條件的選擇至關重要，直接影響修飾反應的專一性。1.試劑的選擇1.試劑的選擇

實驗目的不同，對專一性的要求也不同．因此，選擇試劑在很大程度上要依據(jù)修飾目的。例如，對氨基的修飾可有幾種情況；修飾所有氨基．而不修飾其他基團；僅修飾α-氨基；修飾暴露的或反應性高的氨基以及修飾具有催化活性的氨基等。修飾的部位和程度一般可用選擇適當?shù)脑噭┖头磻獥l件來控制。如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須選擇能引人最大電荷量的試劑。用順丁烯二酸酐可將中性的疏基和酸性pH下帶正電荷的氨基轉變成在中性pH下帶負電的衍生物。如果要修飾的蛋白質(zhì)對有機溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中進行反應，則試劑應選擇在水中有一定溶解性的。在選擇試劑時，還必須考慮反應生成物容易進行定量測定。如果引入的基團有特殊酌光吸收或者在酸水解時是穩(wěn)定的，則可測定光吸收的變化或做氨基酸全分析，這是最方便酌。用同位素標記的試劑雖較麻煩，但有其優(yōu)越性，它可對蛋白質(zhì)修飾反應進行連續(xù)測定，進行反應動力學的研究。試劑的大小也要注意。試劑體積過大，往往由于空間障礙而不能與作用的基團接近，一般來說，試劑的體積小一些為宜，這樣既能保證修飾反應順利進行，又可減少因空間障礙而破壞蛋白質(zhì)分子嚴密結構的危險。

一般地說，選擇蛋白質(zhì)修飾劑要考慮如下一些問題：

選擇性地與一個氨基酸殘基反應；反應在酶蛋白不變性的條件下進行：標記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過降解分離出來，進行鑒定；反應的程度能用簡單的技術測定。當然，不是單獨一種試劑就能滿足所有這些條件。一種試劑可能在某一方面比其他試劑優(yōu)越，而在另一方面則較差。因此，必須根據(jù)實驗目的和特定的樣品來決定使用什么樣的試劑。修飾反應要完成到什么程度；對個別氨基酸殘基是否專一。在反應條件下，修飾反應有沒有限度；修飾后蛋白質(zhì)的構象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物：反應是否需要可逆；是否適合于建立快速、方便的分析方法等。在決定選擇某一修飾方法之前，對上述問題必須有一個權衡的考慮。用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應具備以下一些特征2．反應條件的選擇

蛋白質(zhì)與修飾劑作用所要求的反應條件，除允許修飾能順利進行外，還必須滿足如下要求：一是不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性。為了證明這一點，必須做對照試驗。二是有利于專一性修飾蛋白質(zhì)。為此，反應條件應盡可能在保證蛋白質(zhì)特定空間構象不變或少變的情況下進行。反應的溫度、pH都要小心控制。反應介質(zhì)和緩沖液組成也要有所考慮。緩沖液可改變蛋白質(zhì)的構象或封閉反應部位，因而影響修飾反應，如磷酸鹽是某些酶的競爭性抑制劑，因而該離子的結合可能封閉修飾部位。碳酸酐酶的酯酶活力能被氯離子抑制，因而修飾反應所用緩沖液不應含有氯離于。3反應的專一性活性蛋白質(zhì)特殊的空間結構能影響某些基團的活性。蛋白水解酶分子中的活性絲氨酸是一個很突出的例子。二異丙基氨磷酸酯(DFP)能與胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸作用，結果迅速導致酶失活。但DFP在同樣條件下卻不能與姨凝乳蛋白酶原及一些簡單的模擬化合物作用。在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團，如上述活性絲氨酸在適當條件下只是其本身發(fā)生作用，而其他基團皆不作用，這種現(xiàn)象稱為“位置專一性”，因為這是由于它在蛋白質(zhì)分子中所處的位置環(huán)境所決定的。

在蛋白質(zhì)化學修飾研究中，反應的專一性非常重要。若修飾劑專一性較差，除控制反應條件外，還可利用其他途徑來實現(xiàn)修飾的專一性。

(1)利用蛋白質(zhì)分子中某些基團的特殊性(2)選擇不同的反應pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)(pKa)是不同的。所以控制不同的反應pH，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的專一性。例如，用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)對蛋白質(zhì)進行修飾時，試劑可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側鏈及α-氨基、ε-氨基發(fā)生作用。當反應pH為6時，只專一地與組氨酸的咪唑基作用：當反應pH為3時，則專一地與甲硫氨酸側鏈作用。在這樣酸性pH下，比較活潑的巰基和氨基都以帶質(zhì)子的形式存在．而變成不活潑狀態(tài)，如式(3-4)所示：

(3)利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性

在高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基異脲和亞氨酸，等可將氨基轉變成脲和胍的衍生物。雖然巰基也能與上述試劑作用，但因pH高，與巰基形成的產(chǎn)物迅速被分解。親和標記是實現(xiàn)專一性修飾的重要途徑。親和標記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結構和與蛋白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。因此，在作用前，試劑先以非共價形式結合到蛋白質(zhì)的活性部位上，然后再發(fā)生化學作用，將試劑置于活性部位基團上。這種方法在研究酶的活性部位時特別有用。例如，對甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白翅的活性絲氨酸上。(4)親和標記(5)差別標記

在底物或抑制劑存在下進行化學修飾時，由于它們保護著蛋白質(zhì)的活性部位基團，使這些基團不能與試劑作用。然后將過量的底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位素標記的同樣試劑作用，結果只有原來被底物或抑制劑保護的基團是帶放射性同位素標記的。用這一方法可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團。(6)利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異有時在結晶狀態(tài)下進行反應，可以提高修飾的專一性。例如，核糖核酸酶在晶體狀態(tài)下進行逐甲基化時．反應主要集中在119號組氨酸上，對第12號組氨酸的修飾很少，兩者之比為60：1。但在水溶液中進行同樣的修飾時，兩者之比為15：1，換言之，在晶體狀態(tài)下羧甲基化反應的專一性比溶液狀態(tài)下提高3倍。二、修飾程度和修飾部位的測定測定修飾基團和測定修飾程度的實驗方法在文獻中已有詳細討論。這里只能簡述概況。用光譜法追蹤檢查最簡單、最有用，而且還能很容易計算出修飾速度。此法要求修飾后的衍生物具有獨特的光譜或它的光譜與修飾劑的不同，但能符合這個條件的試劑不多。最常使用的是間接法。被修飾的蛋白質(zhì)羥總降解和氨基酸分析后鑒定修飾部位。被修飾的殘基羥分離純化后，可通過它含有的同位素標記量或通過有色修飾劑的光譜強度、順磁共振譜、熒光標記量、修飾劑的可逆去除等來測定反應程度。測定一個被修飾氨基酸的出現(xiàn)，要比測定多個相同氨基酸中有一個消失更準確。理想的情況是被修飾的氨基酸在水解條件下是穩(wěn)定的，而且在層析圖譜中有一個獨特的位置。使用蛋白水解酶降解。一般可避免不穩(wěn)定問題。但有些修飾了的殘基，即使在酶解條件下也不穩(wěn)定，或者其他殘基阻礙蛋白水解酶對臨近肽鍵的進攻。這時常進行殘基部位的第二次修飾，以產(chǎn)生另外一種更穩(wěn)定的修飾。由第二次修飾的結果．可以得到第一次修飾的程度。例如，已羥乙酰化的蛋白質(zhì)再羥二硝基苯?；?，然后酸水解，測定DPN-氨基酸和回收氨基酸的數(shù)目，再與總數(shù)進行比較，則能知道修飾程度。2．化學修飾數(shù)據(jù)的分析化學修飾中，可以測定許多實驗參數(shù)，這些參數(shù)是與修飾殘基的數(shù)目及其對蛋白質(zhì)生物活性的影響相關聯(lián)的。這里只介紹表示化學修飾數(shù)據(jù)的最常用的方法以及從這類數(shù)據(jù)分析中所能得到的信息。(1)化學修飾的時間進程分析

時間進程分析數(shù)據(jù)是化學修飾的基本數(shù)據(jù)之一。如果修飾過程中有光譜變化．可直接追蹤個別側鏈的修飾。但常常是追蹤修飾對蛋白質(zhì)某些酶學參數(shù)(活性、變構配體的調(diào)節(jié)作用等)的影響來監(jiān)測修飾過程。根據(jù)獲得的時間進程曲線，可以了解修飾殘基的性質(zhì)和數(shù)目、修飾殘基與蛋白質(zhì)生物活性之間的關系等。時間進程曲線的測定實際上是蛋白質(zhì)失活速度常數(shù)的測定。在大多數(shù)修飾實驗中，修飾劑相對于可能修飾的殘基是大大過量的，此時可以認為是假一級反應。從殘余活力的對數(shù)對時間所做的半對數(shù)圖可求出失活的速度常數(shù)。若蛋白質(zhì)中有兩個以上殘基與活力有關，且與修飾劑反應速度很不相同，則所得殘余活力對數(shù)對修飾時間的半對數(shù)圖為多相的。有時修飾劑在修飾反應過程中本身又發(fā)生水解作用(如焦碳酸二乙酯)，可先在同樣條件下實驗測定試劑水解的速度常數(shù)，然后再求出表觀一級失活速度常數(shù)Kobs值。在修飾劑與靶蛋白不形成特殊復合物的情況,Kobs對修飾劑濃度所做的圖應為一直線，且通過原點。在有些例子中，如用親和試劑修飾蛋白質(zhì)時，在親和試劑和蛋白質(zhì)之間先形成可逆的特殊復合物，然后再發(fā)生失活作用。這時，由Kobs對試劑濃度作圖，則得一條雙曲線。例子現(xiàn)以色氨酸合成酶4-亞基精氨酸-148(apo-β-2-Arg-148)的化學修飾為例，說明修飾數(shù)據(jù)的分析。用苯甲酰甲醛修飾色氨酸合成酶β-亞基(apo-β-2)，可使該亞基喪失絲氨酸脫氨酶活力(見圖3-1)。用圖3-l(a)的數(shù)據(jù)計算假一級速度常數(shù)，再用速度常數(shù)的倒數(shù)對試劑濃度的倒數(shù)作圖，得圖3—l(b)。圖3-1苯甲酰甲醛濃度對色氨酸合成酶A-亞基失活速度的影響(a)，由(a)算出的一級速度常數(shù)(Kobs)的倒數(shù)對試劑濃度的倒數(shù)作圖(b)

由橫軸截距(1/Kd))算得解離常數(shù)為3.7mmol圖3-l(b)。該圖表明，苯甲酰甲醛在使亞基失活以前，與該亞基形成了可逆復合物，由圖算得解離常數(shù)為3.7mmol。這種分析并不能指出，要使亞基失活必須修飾多少個殘基。但是，用放射性苯甲酰甲醛修飾時，則可測定每個亞基被修飾的精氨酸的物質(zhì)的量，以此物質(zhì)的量對殘余活力百分數(shù)作圖，則可見，每個亞基只有一個部位被修飾(見圖3-2)。圖3-2中的插圖為修飾酶的紫外吸收差譜。二苯甲酰甲醛與精氨酸加合物的消光系數(shù)為11000mol-1.cm-1。用此消光系數(shù)可算得每個亞基大約被修飾0.96個精氨酸殘基，與用放射性方法測得值是一致的。用溴化氰裂解修飾的亞基，分離含放射性標記的片斷，羥氨基酸分析,得知,此片斷為含2個精氨酸殘基的肽。再用胃蛋白面水解這個溴化氰裂解片斷，得到一個單一標記的片斷。羥氨基酸分析得知，這個片斷含有精氨酸-148。圖3-2苯甲酰甲醛修飾β-亞基的程度對其活力的彩響(2)確定必需基團的性質(zhì)和數(shù)目蛋白質(zhì)分子中某類例鏈基團在功能上雖有必需和非必需之分，但它們往往都能與某一試劑起反應。長期以來，人們沒有找到生物活力與必需基團之間的定量關系，也就無法從實驗數(shù)據(jù)中確定必需基團的性質(zhì)和數(shù)目。1961年Ray等提出用比較一級反應動力學常數(shù)的方法來確定必需基團的性質(zhì)和數(shù)目，但此法的局限性很大。1962年鄒承魯提出更具普遍應用意義的統(tǒng)計學方法，建立了所謂鄒氏作圖法。用此法可在不同修飾條件下，確定酶分子中必需基團的數(shù)目和性質(zhì)。鄒氏方法的建立不僅為蛋白質(zhì)修飾研究由定性描述轉入定量研究提供了理論依據(jù)和計算方法，而且確定蛋白質(zhì)必需基團也是蛋白質(zhì)工程設計的必要前提。三、化學修飾結果的解釋1．蛋白質(zhì)功能改變的解釋在確證試劑已羥作用于蛋白質(zhì)的基礎上，除用物化方法(如旋光色散、圓二色性)驗證修飾蛋白質(zhì)在溶液中的構象是否發(fā)生了顯著變化外，還必須進一步證明，修飾作用是否發(fā)生在活性部位上，常用的方法有：①如果修飾發(fā)生在活性部位或必需基團上，則蛋白質(zhì)活性的喪失與修飾程度一定呈某種化學計量關系(計算的比例關系)，而且底物(或己確定是與活性部位結合的抑制劑)必然能降低修飾蛋白的失活程度，而與活性部位不能結合的分子則沒有這種影響；②當采用可逆保護試劑時，修飾失活的蛋白質(zhì)隨保護基的去除可重新恢復活力，而且活力恢復程度應與保護基去除量呈一定比例關系。例外當然，修飾劑也可能修飾遠離活性部位的氨基酸，結果使蛋白質(zhì)構象發(fā)生改變，擾亂了活性部位的精巧結構，從而造成蛋白質(zhì)活力喪失。引入帶電或龐大基團時有可能出現(xiàn)這種情況。使用部位專一試劑則可避免這個弊病。酶羥化學修飾后，一般活力要有所下降，但也有例外，如細胞色素C分子中5個氨基都用三硝基苯磺酸修飾后，導致活力喪失。但若用O-甲基異脲作用、將氨基轉變成堿性更強的胍基時，卻能增加其活力。這說明不是氨基本身，而是正電荷是它表現(xiàn)活力所必需的。修飾后酶活力的最適pH，對底物的專一性都可能發(fā)生改變，對金屬的需要在性質(zhì)和程度上也會有所不同。酶活力的改變可能是由于米氏常數(shù)的改變或最大反應速度的改變引起的，因此，應作適當?shù)臏y量區(qū)分這兩種現(xiàn)象。

2修飾殘基的不穩(wěn)定性原始修飾以后，還可能發(fā)生共價改變。如?；D移、巰基轉移、鹵素轉移及二硫交換過程可能自發(fā)地或在純化、降解過程中發(fā)生。蛋白質(zhì)中的碘代酪氨酸相當不穩(wěn)定，除對光和氧敏感外，在層析過程中或在弱酸性介質(zhì)中，有碘離子存在時，能發(fā)生脫碘化作用。光氧化的組氨酸，羥酸水解后，產(chǎn)生許多未知產(chǎn)物，但這些未知產(chǎn)物峰的位置與正常氨基酸的降位重疊。3．沒有被發(fā)現(xiàn)的修飾味唑基、巰基、放基甚至苯酚的?；a(chǎn)物在反應條件下不穩(wěn)定或在以后的純化中被水解。因而檢測不出。這種暫時性的修飾對構象的影響無疑會改變其他功能基的反應性和可接近性。C端的羧基能與一定強度的?；瘎┳饔茫瑫簳r形成混合酸酐，結果使羧肽酶不能除去C端殘基。非末端較基(特別是天冬氨酸的非末端羧基)也能產(chǎn)生環(huán)化亞酰胺和β-天冬氨酸肽鍵。有些修飾反應不能檢測出來，只是由于它們在蛋白質(zhì)化學中不占優(yōu)勢地位，如汞鹽常用于修飾巰基，但它也能裂解二硫鍵；色氨酸雖能形成各種絡合物，并能進行加成反應，但由于修飾不產(chǎn)生顯著的光譜變化，或因色氨酸的光譜常被酪氨酸光譜所掩蓋，故從光譜上可能看不到修飾產(chǎn)物。第三節(jié)酶蛋白側鏈的修飾蛋白質(zhì)側鏈上的功能基主要有：氨基、羧基、巰基、味唑基、酚基、吲哚基、胍基、甲硫基等。修飾上述每一種功能基都有好多種試劑可供利用。因為好多試劑不是特別專一的，這里不作詳細介紹，只介紹那些應用廣泛，又能達到某種特殊目的的試劑。根據(jù)化學修飾劑與酶分子之間反應的性質(zhì)不同，修飾反應主要分為?；磻?、烷基化反應、氧化和還原反應、芳香環(huán)取代反應等類型。下面介紹化學修飾氨基酸殘基的主要常用試劑。附錄1列出了目前常用的一些修飾劑對蛋白質(zhì)側鏈基團的反應性。一、羧基的化學修飾幾種修飾劑與羧基的反應如式(3-5)一式(3-7)所．其中水溶性的碳二亞胺類特定修飾酶的羧基已成為最普通的標準方法，它在比較溫和的條件下就可以進行。但是在一定條件下，絲氨酸、半胱氨酸和酷氨酸也可以反應。5-1

二、氨基的化學修飾賴氛酸的ε-NH2以非質(zhì)子化形式存在時親核反應活性很高，因此容易被選擇性修飾可供利用的修飾劑也很多，如式(3-8)一式(3-13)所示。

氨基的烷基化已成為一種重要的賴氨酸修飾方法，修飾劑包括有鹵代乙酸、芳基鹵和芳香族磺酸。在硼氫化納等氫供體存在下酶的氨基能與醛或酮發(fā)生還原烷基化反應，所使用的羰基化合物取代基的大小對修飾結果有很大影響。其中三硝基苯磺酸(TNBS)是非常有效的一種氨基修飾劑，它與賴氨酸殘基反應，在420nm和367nm則能夠產(chǎn)生特定的光吸收。氰酸鹽使氨基甲氨酰化形成非常穩(wěn)定的衍生物是一種常用的修飾賴氨酸殘基的手段，該方法優(yōu)點是氰酸根離子小，容易接近要修飾的基團。磷酸吡哆醛(PLP)是一種非常專一的賴氨酸修飾劑，它與賴氨酸殘基反應，形成希夫堿后再用硼氫化鈉還原，還原的PLP衍生物在325nm處有最大光吸收，可用于定量。在蛋白質(zhì)序列分析中氨基的化學修飾非常重要。用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化學修飾方法最常用的有2，4二硝基氟苯(DNFB)法(DNFB又稱sanger試劑),丹磺酞氯(DNS)法，苯異硫氰酸酯(PITC)法。

三、精氨酸胍基的修飾

具有兩個臨位羰基的化合物，如丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和苯乙二醛是修飾精氨酸殘基的重要試劑，因為它們在中性或弱堿條件下能與精氨酸殘基反應如式(3-14)一式(3-16)。精氨酸殘基在結合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起著重要作用。還有一些在溫和條件下具有光吸收性質(zhì)的精氨酸殘基修飾劑，如4-羥基-3-硝基苯乙二醛和對硝基苯乙二醛。精氨酸與修飾劑的反應

四、巰基的化學修飾巰基在維持亞基間的相互作用和酶催化過程中起著重要作用。因此開發(fā)了許多修飾巰基的特異性修飾劑。如式(3-17)一式(3-22)巰基具有很強的親核性，在含半胱氨酸的酶分子中是最容易反應的側鏈基團。烷基化試劑是一種重要的巰基修飾劑，修飾產(chǎn)物相當穩(wěn)定，易于分析。目前已開發(fā)出許多基于碘乙酸的熒光試劑。馬來酰亞胺或馬來酸酐類修飾劑能與巰基形成對酸穩(wěn)定的衍生物。N-乙基馬來酰亞胺是一種反應專一性很強的巰基修飾刑，反應產(chǎn)物在300nm處有最大吸收。有機汞試劑，如對氯汞苯甲酸對巰基專一性最強，修飾產(chǎn)物在250nm處有最大吸收。5，5’-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman試劑)也是最常用的巰基修飾劑，它與巰基反應形成二硫鍵，釋放出1個2-硝基-5-硫苯甲酸陰離子，此陰離子在412nm處有最大吸收，因此能夠通過光吸收的變化跟蹤反應程度。雖然目前在酶的結構與功能研究中半胱氨酸的側鏈的化學修飾有被蛋白質(zhì)定點突變的方法所取代的趨勢，但是Ellman試劑仍然是當前定量酶分子中巰基數(shù)目的最常用試劑，用于研究巰基改變程度和巰基所處環(huán)境，最近它還用于研究蛋白質(zhì)的構象變化。修飾巰基的特異性修飾劑。如式(3-17)一式(3-22)五、組氨酸咪唑基的修飾組織酸殘基位于許多酶的活性中心，常用的修飾劑有焦碳酸二乙酯(DPC，Diethylpyrocarbonate)和碘代乙酸[式(3-23)一式(3-4)],DPC在近中性pH下對組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應和定量。碘代乙酸和焦碳酸二乙酯都能修飾咪唑環(huán)上的兩個氮原于，碘代乙酸修飾時，有可能將N1取代和N3取代的衍生物分開，觀察修飾不同氮原子對酶活性的影響。六、色氨酸吲哚基的修飾色氨酸殘基一般位于酶分子內(nèi)部，而且比巰基和氨基等一些親核基團的反應性差，所以色氨酸殘基一般不與常用的一些試劑反應。

N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)可以修飾吲哚基，并通過280nm處光吸收的減少跟蹤反應，但是酪氨酸存在時能與修飾劑反應干擾光吸收的測定。2-羥基-5-硝基芐溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯對吲哚基修飾比較專一[式(3-25)一式(3-26)]。但是HNBB水溶性差,與它類似的二甲基(-2-羥基-5-硝基芐基)溴化硫易溶于水，有利于試劑與酶作用。這兩種試劑分別稱為Koshland試劑和Koshland試劑Ⅱ

，它們還容易與巰基作用，因此修飾色氨酸殘基時應對巰基進行保護。七、酪氨酸殘基和脂肪族羥基的修飾酪氨酸殘基的修飾包括酚羥基的修飾和芳香環(huán)上的取代修飾。蘇氨酸和絲氨酸殘基的羥基一般都可以被修飾酚羥基的修飾劑修飾，但是反應條件比修飾酚羥基嚴格些，生成的產(chǎn)物也比酚羥基修飾形成的產(chǎn)物更穩(wěn)定[式(3-27)一式(3-30)]。四硝基甲烷(TNM)在溫和條件下可高度專一性地硝化酪氨酸酚基，生成可電離的發(fā)色基團3-硝基酷氨酸，它在酸水解條件下穩(wěn)定，可用于氨基酸定量分析。蘇氨酸和絲氨酸殘基的專一性化學修飾相對比較少。絲氨酸參與酶活性部位的例子是絲氨酸蛋白水解酶。酶中的絲氨酸殘基對酰化劑如二異丙基氟磷酸酯具有高度反應性。苯甲基磺酰氟(PMSF)也能與此酶的絲氨酸殘基作用，在硒化氫存在下，能將活性絲氨酸轉變?yōu)槲腚装彼幔瑥亩呀z氨酸蛋白水解酶變成了谷胱甘肽過氫化物酶。八、甲硫氨酸甲硫基的修飾雖然甲硫氨酸殘基極性較弱，在溫和條件下，很難選擇性修飾。但是由于硫醚的硫原子具有親核性，所以可用過氧化氫、過甲酸等氧化成甲硫氨酸亞砜。用碘乙酰胺等鹵化烷基酰胺使甲硫氨酸烷基化[式(3-31)一式(3-32)]。第四節(jié)酶的親和修飾酶的位點專一性修飾是根據(jù)酶和底物的親和性，修飾劑不僅具有對被作用基團的專一性，而且具有對被作用部位的專一性，即試劑作用于被作用部位的某一基團，而不與被作用部位以外的同類基團發(fā)生作用。這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑。一般它們都具有與底物相類似的結構，對酶活性部位具有高度的親和性，能對活性部位的氨基酸殘基進行共價標記。因此這類專一性化學修飾也稱為親和標記或?qū)Ｒ恍缘牟豢赡嬉种?。一、親和標記

雖然已開發(fā)出許多不同氨基酸殘基側鏈基團的特定修飾劑并用于酶的化學修飾中，但是這些試劑即使對某一基團的反應是專一的，也仍然有多個同類殘基與之反應。因此對某個特定殘基的選擇性修飾比較困難。為了解決這個問題。開發(fā)了親和標記試劑。用于親和標記的親和試劑作為底物類似物應符合如下條件：在使酶不可逆失活以前，親和試劑要與酶形成可逆復合物；親和試劑的修飾程度是有限的；沒有反應性的競爭性配體的存在應減弱親和試劑的反應速度；親和試劑體積不能太大，否則會產(chǎn)生空間障礙；修飾產(chǎn)物應當穩(wěn)定，便于表征和定量。親和試劑可以專一性地標記于酶的活性部位上，使酶不可逆失活，因此也稱為專一性的不可逆抑制。這種抑制又分為Ks型不可逆抑制和Kcat型不可逆抑制。Ks型抑制劑是根據(jù)底物的結構設計的,它具有和底物結構相似的結合基團，同時還具有能和活性部位氨基酸殘基的側鏈基團反應的活性基團。因此也可以和酶的活性部位發(fā)生特異性結合，并且能夠?qū)钚圆课粋孺溁鶊F進行修飾，導致酶不可逆失活。這類修飾的特點是：底物、競爭性抑制劑或配體應對修飾有保護作用；修飾反應是定量定點進行的。這種修飾作用不同于基團專一性的作用方式(圖3-3)。

Kcat型抑制劑專一性很高，因為這類抑制劑是根據(jù)酶催化過程設計的，它具有酶的底物性質(zhì)，還有一個潛在的反應基團在酶催化下活化后，不可逆地抑制酶的活性部位。所以Kcat型抑制劑也稱為“自殺性抑制刑”。自殺性抑制劑可以用來作為治療某些疾病的有效藥物?；鶊F專一性與位點專一性的作用方式圖

圖3-3基團專一性與位點專一性(a)基團專一性修飾；(b)位點專一性修飾——親和標記二、外生親和試劑與光親和標記親和試劑一般可分為內(nèi)生親和試劑和外生親和試劑，前者是指試劑本身的某部分通過化學方法轉化為所需要的反應基團，而對試劑的結構沒有大的擾動；后者是把反應性基團加入到試劑中去，如將鹵代烷基衍生物連到腺嘌呤上(圖3，4)；氟磺酰苯酰基連到腺嘌呤核苷酸上(圖3-5)。

圖3-4N-6-對-溴乙酸胺-芐基-ADP的結構圖3-5腺苷-5’-(對-氟磺酰苯酰磷酸)的結構

Aden-腺苷

光親和試劑光親和試劑是一類特殊的外生親和試劑，它在結構上除了有一般親和試劑的特點外，還具有一個光反應基團。這種試劑先與酶活性部位在暗條件下發(fā)生特異性結合，然后被光照激活后，產(chǎn)生一個非?；顫姷墓δ芑鶊F能與它們附近幾乎所有基團反應，形成一個共價的標記物(圖3-6)。第五節(jié)酶的化學交聯(lián)酶的化學交聯(lián)是一類重要的化學修飾。交聯(lián)劑是具有兩個反應活性部位的雙功能基團可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應。交聯(lián)劑分為同型雙功能試劑、異型雙功能試劑和可被光活化試劑3種類型，每類中又分為可裂解型和不可裂解型。同型雙功能交聯(lián)劑兩端具有相同的活性反應基因，可與氨基反應的雙亞氨酯是一個典型的同型雙功能交聯(lián)劑。此外，N-羧琥珀酰亞胺酯、二硝基氟苯等同型雙功能試劑都對氨基有專一性。但是戊二醛除與氨基反應外還能與羥基反應，異型雙功能交聯(lián)劑一端與氨基作用，另一端一般與硫基作用，但是用碳二亞胺時，第二個反應基團是羧基?？杀还饣罨母呓宦?lián)劑一端與酶反應后，經(jīng)光照，另一端產(chǎn)生一個活性反應基團(自由基)如碳烯或氮烯，它們具有高反應性，沒有專一性。交聯(lián)劑種類繁多，不同的交聯(lián)劑其長度、氨基酸專一性、交聯(lián)速度和交聯(lián)效率都不相同。圖3-7是一些最常用的交聯(lián)劑。最常用的交聯(lián)劑圖3-7某些常用交聯(lián)劑的結構可裂解型交聯(lián)劑能將兩條多肽鏈交聯(lián)后．再用二硫蘇糖醇等還原試劑切斷交聯(lián)的化學鍵。這可用于多肽鏈的研究。不可裂解型的化學交聯(lián)，可用于固定化酶或修飾酶改善酶的生物化學性質(zhì)和免疫學性質(zhì)。

第六節(jié)酶化學修飾的應用

本世紀50年代末期，化學修飾酶的目的主要用來研究酶的結構與功能的關系，是當時生物化學領域的研究熱點。它在理論上為酶的結構與功能關系的研究提供實驗依據(jù)。如酶的活性中心的存在就是可以通過酶的化學修飾來證實的。為了考察酶分子中氨基酸殘基的各種不同狀態(tài)和確定哪些殘基處于活性部位并為酶分子的特定功能所必需，研制出許多小分子化學修飾劑，進行了多種類型的化學修飾。自70年代末以來，用天然或合成的水溶性大分子修飾酶的報道越來越多。這些報道中的酶化學修飾的目的在于，人為地改變天然酶的某些性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性甚至創(chuàng)造出新的活性，擴大酶的應用范圍。酶經(jīng)過修飾后，會產(chǎn)生各種各樣的變化，概括起來有：①提高生物活性(包括某些在修飾后對效應物的反應性能改變)；②增強在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性；③針對待異性反應降低生物識別能力，解除免疫原性；④產(chǎn)生新的催化能力(圖3-8)。酶化學修飾的應用圖示圖3-8酶化學修飾的應用一、化學修飾在酶的結構與功能研究中的應用化學修飾在研究酶的結構與功能方面應用得比較多，研究得也比較細，特別是可逆的化學修飾在酶結構與功能的研究中能提供大量信息。1．研究酶空間結構酶分子中氨基酸側鏈的反應性與它周圍的微環(huán)境密切相關，用具有熒光性質(zhì)的修飾劑修飾后，通過熒光光譜的研究，可以了解溶液狀態(tài)下的酶分子構象；研究酶分子的解離——締合現(xiàn)象。通過熒光偏振技術還可以測酶分子旋轉弛豫時間，由此推算出酶分子大小、形態(tài)及構象變化。用化學修飾法確定某種氨基酸殘基在酶分子中所存在的狀態(tài)是常用的方法。通常情況下酶分子表面基團能與修飾劑反應，而不能與修飾劑反應的基團一般是埋藏在分子內(nèi)或形成次級鍵。通過雙功能試劑交聯(lián)修飾可以測定酶分子中特定基團之間的距離。在酶的晶體結構分析中，有時需要用化學修飾方法制備含重原子的酶分子衍生物，這將有利于晶體結構分析。2．確定氨基酸殘基的功能化學修飾與底物保護相結合，可用于研究底物對修飾速度和修飾程度的影響。如果修飾反應的可逆性對應著生物功能的改變，則可以為確定某一殘基的可能功能提供一定的證據(jù)。如在丙酮酸激酶中精氨酸殘基的修飾反應過程中，伴隨著精氨酸殘基的修飾，酶分子可逆地失話，底物保護作用說明酶分子在底物磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸結合位點具有一個必需的精氨酸殘基。化學修飾能夠用于酶變構部位必需氨基酸殘基的分析和協(xié)同相互作用所必需殘基的表征。3．測定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量雖然氨基酸分析法也可以測酶分子中氨基酸的數(shù)量，但是如果只需測定某一種氨基酸的數(shù)量時，就可以用定量的化學修飾方法，因為這樣即快速又靈敏．如用三硝基苯磺酸測定氨基；用對氯汞苯甲酌測巰基等。其他氨基酸殘基也有相應的試劑用于定量測定，見表3-2?；瘜W修飾在酶的結構與功能研究中的應用除上述三個方面以外，在測定酶的氨基酸序列和研究變構酶時，許多方法也都是以化學修飾為基礎。如胰蛋白酶對精氨酸和賴氨酸具有高度特異性，通常用此酶水解酶分子，以制備肽碎片，為了防止精氨酸和賴氨酸相互干擾，可選擇性化學修飾賴氨酸和精氨酸，使水解局限在其中一種殘基的肽鍵上。定量測定氨基酸殘基相應的試劑表3-2一些常用來進行蛋白質(zhì)定量的化學修飾二、化學修飾酶在醫(yī)藥和生物技術中的應用酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。因此，愈來愈多的酶制劑已用于疾病的診斷治療和預防；食品發(fā)酵和化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，環(huán)境保護和監(jiān)測以及基因工程等生物技術領域。但是酶作為蛋白質(zhì)，其異體蛋白質(zhì)的抗原性由于受蛋白質(zhì)水解酶水解和抑制作用、在體內(nèi)半衰期短、不穩(wěn)定、不能在靶部位聚集、不合適的最適pH等缺點嚴重影響醫(yī)用酶的使用效果，甚至無法使用。工業(yè)用酶常常由于酶蛋白抗酸、堿和有機溶劑變性能力差，不耐熱，容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制，工業(yè)反應要求的pH和溫度不在酶反應的最適pH和最適溫度范圍內(nèi)，底物不溶于水或酶的pH值高等缺點，限制了酶制劑的應用范圍。如何提高酶的穩(wěn)定性、解除抗原性、改變酶學性質(zhì)(最適pH，最適溫度Km值，催化活性和專一性)，擴大酶的應用范圍的研究越來越引起人們的重視。分子酶工程(Mo1ecularenzymeengineering)可以從分子水平改造酶，彌補天然酶的缺陷，并賦予它們某些新的機能和優(yōu)良特性?；瘜W修飾是分子酶工程的重要手段之一。事實證明，只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎上，能夠在較大范圍內(nèi)改變酶的性質(zhì)，如在醫(yī)藥方面，化學修飾可以提高醫(yī)用酶的穩(wěn)定性，延長它在體內(nèi)半寰期，抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，降低免疫原性和抗原性。如今對醫(yī)用酶的修飾是Landsteiner和VanderScher的早期工作的發(fā)展，他們研究偶聯(lián)于蛋白質(zhì)的短肽對抗原特異性的影響，隨后Sela等做了大量的工作，他們通過使用游離的或者與蛋白質(zhì)結合的合成多肽來闡明免疫反應，他們發(fā)現(xiàn)將一定的多聚氨基酸結合到蛋白質(zhì)上能降低它們的免疫原性和抗原性。在生物技本領域，化學修飾酶能夠提高面對熱、酸、堿和有機镕劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適pH等酶學性質(zhì)?；瘜W修飾酶還可以創(chuàng)造新的催化性能。酶的活性部位是酶進行催化反應之所在。對遠離活性部位的氨基酸殘基進行化學修飾，作較大改變，但又不使酶失活是可能的。此外，有的酶需要輔因子，輔因子的改變或轉移會使酶的性質(zhì)發(fā)生很大變化。

1．酶的表面化學修飾(1)大分子修飾可溶性大分子．如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、葡聚糖、環(huán)糊精、乙烯順丁烯二酰阱共聚物、羧甲基纖維素、多聚唾液酸、肝素等可通過共價鍵連于酶分子表面，形成覆蓋層。其中相對分子質(zhì)量在500-20000u范圍內(nèi)的PEG類修飾劑應用最廣，它是既能溶于水，又可以溶于絕大多數(shù)有機溶劑的兩親分子，它一般沒有免疫原性和毒性，其生物相容性已經(jīng)通過美國FDA認證。PEG分子末端有兩個能被活化的羥基。但是化學修飾時多采用單甲氧基聚乙二醇(MPEG)。

MPEG只帶有一個可被活化的羥基，按不同的活化劑，可將MPEG類修飾劑分為：①MPEG均三嗪類衍生物。這類修飾劑包括MPEGl[2-(O-methoxy-polyelhyleneglycol)]和MPE2[2，4-bis(O-methox-polyelhyleneglycol)-6-dichloro-S-tri-azinel，MPEG的羥基與均三嗪即三聚氯氰的氯反應，控制不同反應條件，可以分別制得活化的MPEGl和MPEG2。被三聚氯氰活化的修飾劑引入了活潑的氯，可以與酶的氨基反應。因為MPEGl在一個三聚氯氰環(huán)上只連一個MPEG分子，MPEG2在一個三聚氯氰環(huán)上連兩個MPEG分子，所以在氨基修飾程度相同時，MPEG2修飾酶所引進的MPEG分子數(shù)是MPEGl的二倍，MPEG2的修飾效果好于MPE6l。如圖3-9，圖3-10。MPFGl和MPEG2修

飾

L-天冬

酰

胺

酶

圖3-9天然酶和修飾酶的免疫沉淀曲線②MPEG的琥珀酰亞胺類衍生物MPEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-MPEG),MPEG琥珀酰亞胺琥珀酰胺(SS-MPEG)，MPEG琥珀酰亞胺碳酸酯(SC-MPEG)等MPEG的琥珀酰亞胺類衍生物可以在pH7-l0范圍內(nèi)修飾酶的氨基。

③MPEG氨基酸類衍生物MPEG與亮氨酸的-氨基或賴氨酸上的-氨基和-氨基反應，制備出的MPEG的氨基酸類衍生物可以通過N-羥基琥珀酰亞胺活化。④蜂巢形MPEG(comb-shapedMPEG)聚乙二醇與馬來酸酐形成的共聚物(PM)具有多個反應位點，呈現(xiàn)蜂巢形結構。已制備出活化的PM共聚物；活化MP13(分子質(zhì)量≈100000μ；m≈50,n≈40，R＝CH3)。修飾劑分子中的馬來酸酐直接與酶分子上的氨基酸反應形成酰胺鍵。這些蜂巢形修飾劑將酶分子表面覆蓋上一個陰離子基團。⑤其他PEG衍生物PEG胺類衍生物可以修飾羰基化合物，還可以作為合成其他修飾劑的中間體。異雙功能PEG也可以用來修飾除了氨基以外的其他基團。

修飾劑性質(zhì)對修飾結果有很大影響

選用單甲氧基聚乙二醇、右旋糖酐、磺化右旋糖酐、肝素及小分子乙酸酐對治療白血病的L天冬酰胺酶進行了化學修。表3-3和表3-4表明，不同修飾劑都可在不同程度上降低抗原性，抗原性降低程度與氨基修飾程度存在正相關，氨基修飾程度越高，解除抗原性效果越好。但是不同分子質(zhì)量的右旋糖酐修飾酶，其抗原性的降低和酶活力的減少均與修飾劑分子大小有關。T70和T40右旋糖酐修飾酶，當其氨基修飾程度分別是47.5％和69.8％時，雖然T70修飾酶的修飾程度小于T40修飾酶，但是抗原性降低程度卻是前者大于后者。小分子乙酸酐修飾酶與大分子MPEG1(500μ)修飾酶相比，在降低抗原性和保持修飾酶活力方面小分子修飾劑遠不如大分子修飾劑。其原因可能是抗原決定接有關的氨基雖然被修飾，但是由于修飾劑分子小，遮蓋作用差，抗原決定簇未被有效地破壞。此外，反應pH、溫度以及酶與修飾劑的摩爾比也影響修飾程度和修飾酶的性質(zhì)，其中pH是最重要的條件，一般情況下，增加pH可以提高反應速率。在MPEG修飾反應中，反應pH在8-10之間，溫度保持在4-8℃。酶與MPEG的摩爾比一極為1：3-1：5，反應時間為8-16h。修飾過程采取底物保護酶活性部位的措施可以減少酶活力的損失。修飾L天冬酰胺酶的抗原性L-天冬酰胺酶在有底物保護和無底物保護條件下，與半飽和乙酸鈉溶液(pH7.5，0℃)反應lh，制備乙酸酐修飾酶。比較兩種修飾酶的殘余活力，氨基修飾程度及抗原，抗體結合能力，發(fā)現(xiàn)兩種修飾酶在氨基修飾程度和抗原—抗體結合能力相差無幾的情況下，底物保護修飾酶的活力卻是無底物保護修飾酶的3倍(表3-5)。

乙酸酐修飾底物保護酶的抗原性

L-天冬酰胺酶在有底物保護和無底物保護的條件下用MPEGl和MPEG2修飾，結果見表3-6。由此可見，底物保護下的MPEGI修飾酶和MPEG2修飾酶均比無底物保護下的修飾酶活力高。當MPEG2修飾酶在有底物保護和無底物保護下其氨基修飾分別為51個和52個時，抗原性完全解除，但是酶活力前者卻是后者的3倍。從表3-5及表3-6還可以看出無底物保護的乙酸酐修飾酶和MPEG修飾酶，雖然抗原性有所降低，但是酶活力損失嚴重。其原因可能是氨基與酶的活性部位有關。在修飾參與抗原決定簇的氨基同時，無選擇地修飾了酶活性部位的氨基，導致酶失活；也可能是修飾了參與維持酶活性部位天然構象的有關氨基，導致酶失活。采用底物保護酶活性部位的方法，可以使與活性相關的氨基不被修飾，而有效地修飾與抗原決定簇有關的氨基，在降低或解除抗原性的同時，盡可能達到保持酶活力的目的。除液相修飾法外，還可以來用固相修飾法，即酶吸附在離子交換柱上，在一定時間內(nèi)PEG修飾劑循環(huán)不斷地流過柱子。反應結束后，用緩沖液沖洗掉其他副產(chǎn)物和過量的PEG。改變緩沖液中鹽的濃度可以將修飾酶洗脫下來。為了保持相同蛋白質(zhì)濃度，柱子用相同量的未修飾酶再生，PEG再一次循環(huán)修飾、洗脫、分離修飾酶。例子迄今，已有l(wèi)00多種蛋白質(zhì)(其中許多是酶)被修飾后在臨床應用中顯出許多優(yōu)良特性。如穩(wěn)定性提高，體內(nèi)半衰期延長，免疫原性和毒性降低或消除，提高度滲透性，改善在體內(nèi)的生物分布與代謝行為，提高療效，增加在有機溶劑中的溶解度和耐有機溶劑變性的能力等。聚乙二醇、右旋糖酐、肝素等可溶性大分子制備的修飾酶具有許多有利于應用的新性質(zhì)。如聚乙二醇修飾的天冬酰胺酶不僅可降低或消除酶的抗原性，而且可以提高酶的抗蛋白質(zhì)水解的能力，延長酶在體內(nèi)半衰期，提高藥效。L-天冬酞胺酶(L-asparaginase)(EC.3.5.1.1)具有較強的抗腫瘤作用。它能將腫瘤細胞生長所需的L-天冬酰胺水解為天冬氨酸和氨，從而特異并有效地抑制腫瘤細胞的惡性生長。目前，大腸桿菌L-天冬酰胺酶作為治療淋巴性白血病、惡性淋巴腫瘤的酶制劑已在國外應用于臨床，并且是治療急性淋巴性白血病治療指數(shù)最高的藥物。但由于它來源于微生物，對人而言是一種外源性蛋白質(zhì)，有較強的免疫原性，臨床上常見有進行性免疫反應和全身性過敏反應而限制了其臨床應用。近年來，許多研究結果表明，用聚合物修飾能較好地克服這些缺陷。目前主要采用PEG和右旋糖酐這兩種修飾因子進行修飾。美國FDA正式批準的用于治療急性淋巴性白血病的培門冬酶(pegasargase，商品名為Oncasper)即為L-天冬酰胺酶的聚乙二醇螯合物，該產(chǎn)品已于1994年首先在美國上市。此外．國內(nèi)外諸多研究表明，PEG修飾可顯著降低免疫原性，且延長體內(nèi)半定期，不過酶活回收率較低，只有7％-15％。L-天冬酰胺酶經(jīng)修飾的效果周笑艷等采用SS-PEG對大腸桿其他修飾方法相比更有利于保持酶活力。錢國強等將具有抗癌作用的L-天冬酰胺酶用N，O-羧甲基完聚糖進行化學修飾，以降低酶的抗原性，提高其在體內(nèi)的半衰期。Km值是決定L-天冬酰胺酶抗癌作用大小的因素之一。血漿中的L-天冬酰胺只有保持在較低水平，才能有效地抑制癌細胞的生長，因而L-天冬酰胺酶要有抗癌活性，必須有高的底物親和力。為此，進行了天然酶和修飾酶Km值的測定，所得結果相差不多，表明L-天冬酰胺酶經(jīng)修飾后基本上不影響它與底物的結合作用，因而不影響它在臨床上的實際應用。人體血漿中含有少量的蛋白酶，能使外源性L-天冬酰胺酶逐漸水解失活。只有當L-天冬酰胺酶具有較強的抗蛋白酶水解作用時，它才能在人體內(nèi)停留較長時間，起到抗癌作用。L-天冬酰胺酶經(jīng)修飾后，與天然酶相比具有較強的抗蛋白酶水解能力。當羧甲基殼聚糖的平均分子質(zhì)量大于l×104u時，L-天冬酰胺酶經(jīng)修飾后可以降低其抗原性，且分子質(zhì)量越大，降低抗原性的效果越好。這是由于IgG抗體可以在蛋白質(zhì)表面的多糖鏈中移動而與蛋白質(zhì)起抗原-抗體反應。將天然酶和羧甲基殼聚糖修飾的L-天冬酰胺酶分別靜脈注射至新西蘭白兔體內(nèi)，在一定時間間隔取血檢測，天然酶和修飾酶在血漿中的清除基本上滿足一級動力學反應，其半衰期分別為1.2h和40h，修飾酶比天然酶提高了33倍。例子精氨酸酶等的修飾效果精氨酸酶具有抗癌作用，它用PEG修飾后