第二章天然產(chǎn)物有效成分的提純分離與結(jié)構(gòu)鑒定

天然產(chǎn)物有效成分的提純分離與結(jié)構(gòu)鑒定第二章

教學(xué)目的與要求：掌握天然產(chǎn)物化學(xué)成分提取分離的原理及方法了解用波譜法測定天然產(chǎn)物化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的一般方法1主要內(nèi)容一、天然產(chǎn)物有效成分提取方法的原理——溶劑提取法與水蒸氣蒸餾法的原理、操作及其特點(diǎn)二、天然產(chǎn)物有效成分分離與精制——天然產(chǎn)物有效成分各種分離方法的原理三、化合物的純度測定四、結(jié)構(gòu)研究的主要程序五、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法——UVIRMSNMR2第一節(jié)天然有效成分的提取溶劑法水蒸氣蒸餾法

升華法

3一、溶劑提取法

1、溶劑提取法及其原理

根據(jù)“相似相溶”原理，選擇與化合物極性相當(dāng)?shù)娜軇⒒衔飶闹参锝M織中溶解出來，同時，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其極性與溶劑極性相差較大的化合物也可溶解出來。

溶劑提取法是根據(jù)天然產(chǎn)物中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對活性成分溶解度大，對不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。

4

2、常用溶劑的特點(diǎn)

環(huán)己烷,石油醚,苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇極性：小————大親脂性：大

————小

親水性：小

————大

5比水重的有機(jī)溶劑：氯仿與水分層的有機(jī)溶劑：環(huán)己烷~正丁醇能與水分層的極性最大的有機(jī)溶劑：正丁醇與水可以以任意比例混溶的有機(jī)溶劑：丙酮~甲醇極性最大的有機(jī)溶劑：甲醇極性最小的有機(jī)溶劑：環(huán)己烷介電常數(shù)最小的有機(jī)溶劑：石油醚常用來從水中萃取苷類、水溶性生物堿類成分的有機(jī)溶劑：正丁醇溶解范圍最廣的有機(jī)溶劑：乙醇6運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。溶劑選擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn)：①溶劑對有效成分溶解度大，對雜質(zhì)溶解度小；②溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化；③溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。3、溶劑的選擇74、各種溶劑提取法

連續(xù)回流提取法等

浸漬法滲漉法煎煮法回流提取法8浸漬法：浸漬法系將天然產(chǎn)物粉末或碎塊裝人適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適宜的溶劑（如乙醇、稀醇或水），浸漬藥材以溶出其中成分的方法。滲漉法：滲漉法是將天然產(chǎn)物粉末裝在滲漉器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過藥材，自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法。901溶劑罐02變頻物料泵03快速滲漏機(jī)04流量計(jì)05滲濾液罐06可調(diào)試電加熱水箱07熱水泵08高效旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器09濃縮液罐10冷凝器11冷卻器12受卻器13真空泵14控制柜01溶劑罐02變頻物料泵03快速滲漏機(jī)04流量計(jì)05滲濾液罐06可調(diào)試電加熱水箱07熱水泵08高效旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器09濃縮液罐10冷凝器11冷卻器12受卻器13真空泵14控制柜01溶劑罐02變頻物料泵

03快速滲漏機(jī)

04流量計(jì)

05滲濾液罐

06可調(diào)試電加熱水箱

07熱水泵

08高效旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器

09濃縮液罐

10冷凝器

11冷卻器

12受卻器

13真空泵

14控制柜

SLNS-快速滲漉提取濃縮機(jī)組工藝流程圖

SLNS-快速滲漉提取濃縮機(jī)組工藝流程圖

10SLNS-快速滲漉提取濃縮機(jī)組11煎煮法：煎煮法是我國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時最好時常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠，多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個煎煮器通過管道互相連接，進(jìn)行連續(xù)煎浸。

回流提取法：應(yīng)用有機(jī)溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。溶劑浸過藥材表面約1～2cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰約1小時后放冷過濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時，或至基本提盡有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。

12連續(xù)回流提取法：應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取天然產(chǎn)物有效成分，不論小型實(shí)驗(yàn)或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實(shí)驗(yàn)室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時才能提取完全。提取成分受熱時間較長，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。

13

提取方法溶劑操作提取效率使用范圍備注浸漬法水或有機(jī)溶劑不加熱效率低各類成分，尤遇熱不穩(wěn)定成分出膏率低，易發(fā)霉，需加防腐劑滲漉法有機(jī)溶劑不加熱—脂溶性成分消耗溶劑量大，費(fèi)時長煎煮法水直火加熱—水溶性成分易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定不宜用回流提取法有機(jī)溶劑水浴加熱—脂溶性成分熱不穩(wěn)定不宜用，溶劑量大連續(xù)回流提取法有機(jī)溶劑水浴加熱節(jié)省溶劑、效率最高親脂性較強(qiáng)成分用索氏提取器，時間長14二、

水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾法，適用于能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的天然產(chǎn)物成分的提取。此類成分的沸點(diǎn)多在100℃以上，與水不相混溶或僅微溶，且在約100℃時存一定的蒸氣壓。當(dāng)與水在一起加熱時，其蒸氣壓和水的蒸氣壓總和為一個大氣壓時，液體就開始沸騰，水蒸氣將揮發(fā)性物質(zhì)一并帶出。

15三、升華法

固體物質(zhì)受熱直接氣化，遇冷后又凝固為固體化合物，稱為升華。天然產(chǎn)物中有一些成分具有升華的性質(zhì)，故可利用升華法直接自天然產(chǎn)物中提取出來。

例如樟木中升華的樟腦（camphor），在《本草綱目》中已有詳細(xì)的記載，為世界上最早應(yīng)用升華法制取藥材有效成分的記述。

茶葉中的咖啡堿在178℃以上就能升華而不被分解。游離羥基蒽醌類成分，一些香豆素類，有機(jī)酸類成分，有些也具有升華的性質(zhì)。

16四、影響提取效果的因素

溶劑提取的效果主要取決于選擇合適的溶劑和提取方法。此外，原料的粉碎程度，提取溫度，濃度差，提取時間，操作壓力，原料與溶劑的相對運(yùn)動等因素也不同程度地影響提取效果。

原料的粉碎程度：原料經(jīng)粉碎后粒度變小，表面能增加，浸出速度加快，但粉碎度過高，樣品粉粒表面積過大，吸附作用增強(qiáng)，反而影響擴(kuò)散速度，并不利于浸出，一般而言粒度以20~60目為適。

17浸出溫度：溫度增加可增大可溶性成分的溶解度、擴(kuò)散系數(shù)。擴(kuò)散速度加快有利于浸提，并且溫度適當(dāng)升高，可使原料中的蛋白質(zhì)凝固、酶破壞而增加浸提液的穩(wěn)定性，但溫度過高，會破壞不耐熱的成分，并且導(dǎo)致浸提液的品質(zhì)劣變。提取的雜質(zhì)含量增高，給后道精制工序帶來困難，一般浸出溫度控制在60~100℃。

浸提時間:原料中的成分隨提取時間延長，提取的得率增加，但時間過長，雜質(zhì)成分溶解也隨之增加，給后序提取精制造成困難，一般而言，熱提1~3h，乙醇加熱回流提取1~2h。

濃度差:濃度差是原料組織內(nèi)的濃度與外周溶液的濃度差異。濃度差越大，擴(kuò)散推動力越大，越有利于提高浸出效率。

18第二節(jié)

天然產(chǎn)物有效成分的分離與精制

根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離

根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配系數(shù)不同進(jìn)行分離

根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離

19一、根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離

1、結(jié)晶結(jié)晶是利用溫度不同引起溶解度的改變而使有效成分以晶體的形式析出以達(dá)到分離物質(zhì)的目的。（1）雜質(zhì)的除去：天然產(chǎn)物經(jīng)過提取分離所得到的成分，大多仍然含有雜質(zhì)，或者是混合成分。有時即使有少量或微量雜質(zhì)存在，也能阻礙或延緩結(jié)晶的形成。所以在制備結(jié)晶時，必須注意雜質(zhì)的干擾，應(yīng)力求盡可能除去。

（2）溶劑的選擇：制備結(jié)晶，要注意選擇合宜的溶劑和應(yīng)用適量的溶劑。合宜的溶劑，最好是在冷時對所需要的成分溶解度較小，而熱時溶解度較大。溶劑的沸點(diǎn)亦不宜太高。

20（3）結(jié)晶溶液的制備：制備結(jié)晶的溶液，需要成為過飽和的溶液。

（4）制備結(jié)晶操作（5）重結(jié)晶及分步結(jié)晶：晶態(tài)物質(zhì)可以用溶劑溶解再次結(jié)晶精制。這種方法稱為重結(jié)晶法。結(jié)晶經(jīng)重結(jié)晶后所得各部分母液，再經(jīng)處理又可分別得到第二批、第三批結(jié)晶。這種方法則稱為分步結(jié)晶法或分級結(jié)晶法。

（6）結(jié)晶純度的判定：化合物的結(jié)晶都有一定的結(jié)晶形狀、色澤、熔點(diǎn)和熔距，一可以作為鑒定的初步依據(jù)。

212、溶劑沉淀：

在溶液中加入另一種溶劑以改變混合溶劑的極性，使一部分物質(zhì)沉淀析出，從而實(shí)現(xiàn)分離。

3、沉淀劑沉淀：（1）金屬離子沉淀；（2）酸堿沉淀；（3）非離子型聚合物沉淀；（4）均相沉淀。4、鹽析沉淀

22二、根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離

1、液-液萃取與分配系數(shù)K值

K=CU/CL

（2-1）

2、分離難易與分離因子β

分離因子β表示

A、B兩種溶質(zhì)在同一溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的比值。即：

β=KA/KB(注：KA>KB)

（2-2）

233、分配比與pH

HA+H2OA-+H3O+

若使該酸性物質(zhì)完全離解，則：24使該酸性物質(zhì)完全游離，即使A-均轉(zhuǎn)變成HA，則：

因?yàn)榉宇惢衔锏膒Ka值一般為9.2~10.8，羧酸類化合物的pKa值約為5，故pH值為3以下，大部分酚酸性物質(zhì)將以非離解形式（HA）存在，易分配于有機(jī)溶劑中；而pH12以上，則將以離解形式（A-）存在，易分配于水中。同理，對于堿性物質(zhì)（B）：

Ka為堿性物質(zhì)（B）的共軛酸（BH+）的離解常數(shù)。

25一般

pH<3時，酸性物質(zhì)多呈非離解狀態(tài)(HA)、堿性物質(zhì)則呈離解狀態(tài)

(BH+)存在，但pH>12,則酸性物質(zhì)呈離解狀態(tài)(A-)、堿性物質(zhì)則呈非離解狀態(tài)(B)存在。據(jù)此,可采用圖1-1所示在不同pH的緩沖溶液與有機(jī)溶劑中進(jìn)行分配的方法,使酸性、堿性、中性及兩性物質(zhì)得以分離。

2627兩相溶劑萃取在操作中還要注意以下幾點(diǎn)：1）先用小試管猛烈振搖約1分鐘，觀察萃取后二液層分層現(xiàn)象。如果容易產(chǎn)生乳化，大量提取時要避免猛烈振搖，可延長萃取時間。如碰到乳化現(xiàn)象，可將乳化層分出，再用新溶劑萃??；或?qū)⑷榛瘜映闉V，或?qū)⑷榛瘜由陨约訜?；或較長時間放置并不時旋轉(zhuǎn)，令其自然分層。乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重時，可以采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。

2）

水提取液的濃度最好在比重1.1～1.2之間，過稀則溶劑用量太大，影響操作。

3）

溶劑與水溶液應(yīng)保持一定量的比例，第一次提取時，溶劑要多一些，一般為水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。

284）一般萃取3～4次即可。但親水性較大的成分不易轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑層時，須增加萃取次數(shù)，或改變萃取溶劑。

4、超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取是以某一介質(zhì)作為萃取劑，在其臨界溫度和臨界壓力之上的條件下，從液體或固體物料中萃取出待分離的組分的一種方法。

超臨界流體由于接近液體的密度使之具有較高溶解度,由于接近氣體的粘度,使之具有良好的流動性能,擴(kuò)散系數(shù)介于氣液之間,使之對待萃取的物料組織有良好的滲透性,這些特征大大提高了溶質(zhì)進(jìn)入超臨界流體的傳質(zhì)速率。

29(1)超臨界流體萃取的特點(diǎn)

萃取過程在較低溫度范圍內(nèi)進(jìn)行,特別適用于具有熱敏性或易氧化的成分。萃取介質(zhì)通常選用二氧化碳,二氧化碳化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,無腐蝕性、無毒性、不易燃、不易爆,萃取后容易從分離成分中脫除,不會造成污染,適用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

工藝條件容易控制,通過對溫度和壓力進(jìn)行調(diào)節(jié),可以實(shí)現(xiàn)選擇性萃取和分離。

萃取產(chǎn)物的理化性質(zhì)保持良好,產(chǎn)品質(zhì)量好,且無溶劑殘留問題,萃取介質(zhì)循環(huán)利用,無環(huán)境污染問題。

超臨界流體萃取需要冷媒和高壓支持且生產(chǎn)量較小,操作成本大。

30（2）超臨界流體萃取的應(yīng)用

由于超臨界流體萃取技術(shù)上有許多元可替代的優(yōu)點(diǎn),近年來獲得高度的重視和廣泛的應(yīng)用,例如中藥有效成分的提取；菌體生成物的分離；香精香料色素的提取；動植物脂肪、脂溶性成分、植物堿、甾醇類物質(zhì)等成分的提取；有機(jī)溶劑以及有害有毒物質(zhì)的脫除等。

315.逆流分溶法(CCD)

液-液萃取分離中經(jīng)常遇到的情況是分離因子β值較小,故萃取及轉(zhuǎn)移操作常須進(jìn)行幾十次乃至幾百次。此時簡單萃取已不能滿足需要,而要采用逆流分溶法(countercurrentdistribution,簡稱CCD)。

32CCD法因?yàn)椴僮鳁l件溫和、試樣容易回收,故特別適于中等極性、不穩(wěn)定物質(zhì)的分離。另外,溶質(zhì)濃度越低,分離效果越好。但是,試樣極性過大或過小,或分配系數(shù)受濃度或溫度影響過大時則不易采用此法分離。易于乳化的萃取溶劑系統(tǒng)也不宜采用。

33346、液液分配色譜柱

將兩相溶劑中的一相涂覆在硅膠等多孔載體上,作為固定相,填充在色譜管中,然后加入與固定相不相混溶的另一相溶劑

(流動相)沖洗色譜柱。這樣,物質(zhì)同樣可在兩相溶劑中相對作逆流移動,在移動過程中不斷進(jìn)行動態(tài)分配而得以分離。這種方法稱之為液-液分配柱色譜法。

（1）正相色譜與反相色譜：分離水溶性或極性較大的成分如生物堿、苷類、糖類、有機(jī)酸等化合物時,固定相多采用強(qiáng)極性溶劑,如水、緩沖溶液等,流動相則用氯仿、乙酸乙醋、丁醇等弱極性有機(jī)溶劑,稱之為正相色譜；但當(dāng)分離脂溶性化合物,如高級脂肪酸、油脂、游離甾體等時,則兩相可以顛倒,固定相可用石蠟油,而流動相則用水或甲醇等強(qiáng)極性溶劑,故稱之為反相分配色譜

(reversephasepartitionchromatography)。

35（2）加壓液相柱色譜特點(diǎn)：加壓液相色譜用的載體多為顆粒直徑較小、機(jī)械強(qiáng)度及比表面積均大的球形硅膠微粒，因而柱效率大大提高。

36三、根據(jù)物質(zhì)的吸附性質(zhì)差別進(jìn)行分離

物理吸附(physicalabsorption)也叫表面吸附,是因構(gòu)成溶液的分子(含溶質(zhì)及溶劑)與吸附劑表面分子的分子間力的相互作用所引起。

特點(diǎn)：①是無選擇性、②吸附與解吸過程可逆、③可快速進(jìn)行。故在實(shí)際工作中用得最廣。如采用硅膠、氧化鋁及活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附色譜即屬于這一類型。

37化學(xué)吸附(chemicalabsorption),如黃酮等酚酸性物質(zhì)被堿性氧化鋁吸附,或生物堿被酸性硅膠吸附等吸附質(zhì)與吸附劑之間要發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的一類吸附。特點(diǎn)：①具有選擇性、②吸附十分牢固、有時甚至不可逆,故用得較少。半化學(xué)吸附(semi-chemicalabsorption),如聚酰胺對黃酮類、醌類等化合物之間的氫鍵吸附,力量較弱,介于物理吸附與化學(xué)吸附之間的一類吸附。381.物理吸附基本規(guī)律

（2）被分離的物質(zhì)與吸附劑、洗脫劑共同構(gòu)成吸附過程中的三要素，彼此緊密相連。（1）物理吸附過程一般無選擇性，但吸附強(qiáng)弱大體遵循“相似者易于吸附”的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律。硅膠、氧化鋁因均為極性吸附劑,故有以下特點(diǎn):

(1)對極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力,極性強(qiáng)的溶質(zhì)將