腎康丸對糖尿病腎病大鼠氧自由基代謝的影響

腎康丸對糖尿病腎病大鼠氧自由基代謝的影響

糖尿病性腎炎（dn）發(fā)病率高，發(fā)病率機制不明確，治療復(fù)雜，療效差，危害巨大。目前認為氧化應(yīng)激(OS)是DN發(fā)病的重要機制,在糖尿病(DM)的慢性并發(fā)癥中可能起主要作用。筆者自主開發(fā)研制的中藥新藥腎康丸(國家發(fā)明專利號200610036515.2)用于治療DN已長達9年余,療效確切;動物實驗研究也表明腎康丸可使DN大鼠24h尿蛋白定量顯著減少、腎臟病理改變明顯減輕。本研究旨在通過觀察腎康丸對DN大鼠氧自由基(OFR)代謝的影響,探討其腎保護作用的機制。1材料和機器1.1實驗動物雄性SD大鼠56只,體質(zhì)量180～230g,購自中山大學(xué)實驗動物中心。1.2大鼠尿微量血藥濃度、超氧化物歧化酶及trizel腎康丸(由黃芪、水蛭、金櫻子、益母草、玉米須、芡實組成),南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科生產(chǎn),制劑號20031214;厄貝沙坦片(安博維),杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn),批號(2000)J-24;鏈脲佐菌素(STZ,Sigma);酶聯(lián)免疫吸附測試大鼠尿微量白蛋白試劑盒(ADL)、過氧化氫酶(CAT)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)試劑盒,南京建成生物工程研究所Trizol(Invitrogen公司,USA);逆轉(zhuǎn)錄RevertraAce(ToYoBo公司,中國上海);PCRTaqdNTPs(鼎國生物);100～600bpmarker(Tiangen公司),PCR引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。1.3儀器、檢測和分析方法752型分光光度計(上海醫(yī)用設(shè)備儀器廠);電熱恒溫水浴箱(Grant公司,USA);萬分之一分析天平(上海天平儀器廠);Ultrospec2000型核酸分析儀(Pharmacia公司,England);GeneAmpPCRSystem9700擴增儀(PE公司,USA);凝膠成像分析系統(tǒng)(UVI公司,England);UNIVERSAL32R臺式低溫離心機(Hettich公司,Germany);2K15高速離心機(Sigma公司,USA);Wallac1420多標記分析系統(tǒng)(VICTOR公司,芬蘭)。2方法2.1大鼠dn模型建立所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后,禁食12h,空腹狀態(tài)下、STZ按55mg/kg一次性腹腔注射,STZ臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1mol/L,pH4.5)配制。另設(shè)正常對照組(n=8),注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。全部大鼠標準飲食喂養(yǎng),不使用胰島素及其他降糖藥物。72h后開始監(jiān)測空腹血糖、尿糖、尿量、24h尿微量白蛋白排泄率的變化,若連續(xù)3次達到下列標準者,即認為DN模型建立:(1)空腹血糖>16.6mmol/L;(2)尿糖強陽性;(3)尿量>原尿量150%;(4)24h尿微量白蛋白排泄率>30mg/24h。大鼠造模成功后,隨機分為4組(n=12):DN模型對照組、腎康丸組、厄貝沙坦組、腎康丸和厄貝沙坦合用組。腎康丸、厄貝沙坦分別按3000、50mg/(kg·d)每日分2次灌服,按照人與大鼠體表面積換算,分別相當于成人300、5mg/(kg·d),連續(xù)8w。正常對照組與模型組灌服等體積生理鹽水。2.2大鼠的量體質(zhì)量實驗結(jié)束前1天代謝籠收集24h尿液,計24h尿量。大鼠處死前稱量體質(zhì)量。以0.3%戊巴比妥鈉按35mg/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,分離血清,-20℃保存;取雙側(cè)腎臟,稱量質(zhì)量后液氮凍藏。2.324h尿微白測定按照試劑盒說明書,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。2.4低溫離心離心測定取腎皮質(zhì)0.5g,冰浴條件用冰冷生理鹽水制成10%的勻漿液,低溫離心機離心,取上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法、GSH-Px活性采用DTNB比色法;CAT活性采用紫外速率測定法、Cu,Zn-SOD活性采用聯(lián)苯三酚自氧化法,嚴格按照試劑盒說明書操作。2.5腎組織中rna的表達及pcr檢測(1)PCR引物:由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。GSH-Px:反義鏈5′-CCACCACCGGGTCGGACATAC-3′,正義鏈5′-CTCTCCGCGGTGGCACAGT-3′,引物長度為290bp;CAT:反義鏈5′-TGGGTTTCTCTTCTGGCTATGG-3′,正義鏈5′-ACGAGATGGCACACTTTGACAG-3′,引物長度為341bp;Cu,Zn-SOD:反義鏈5′-GTCCCCATATTGATGGAC-3′,正義鏈5′-GTTCCGAGGCCGCCGCGCGT-3′,引物長度為192bp;β-actin:反義鏈5′-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′,正義鏈5′-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3′,引物長度為327bp。(2)總RNA提取:每組隨機選取8只大鼠的腎組織按Trizol試劑說明書提取,用核酸分析儀進行定量,D(λ)260/280判斷其純度,根據(jù)測定結(jié)果用去RNA酶水將各組樣品RNA濃度調(diào)為一致,-70℃保存。(3)逆轉(zhuǎn)錄(RT):反應(yīng)液組成:RNaseFreeH2O9μL,5×RTBuffer4μL,dNTPMixture(10mmol/Leach)2μL,Super-RI0.5μL,RT-Enhancer0.5μL,序列特異的下游引物(10pmol/μL)1μL,ReverTraAce1μL,總RNA2μL。42℃反應(yīng)50min。(4)PCR擴增:取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL,加入:RNaseFreeH2O32.5μL,dNTPMixture(2mmol/Leach)5μL,10×PCRBuffer5μL,序列特異的上游引物(10pmol/μL)1μL,序列特異的下游引物(10pmol/μL)1μL,DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL。PCR熱循環(huán)參數(shù)為:94℃變性3min,然后94℃50sec,56℃40sec,72℃1min,循環(huán)35次,終末延伸72℃7min。(5)電泳及半定量分析:取PCR產(chǎn)物10μL,與1μL上樣緩沖液混合,2%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)電泳。電泳后凝膠在紫外燈下觀察、拍照,以β-actin為內(nèi)參照,用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析,以GSH-Px、Cu,Zn-SOD或CATmRNA與β-actinmRNA光密度比值表示GSH-Px、Cu,Zn-SOD或CATmRNA的量。2.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,治療后多組間比較采用OneWayANOVE、SNK檢驗。檢驗水平α=0.05。3結(jié)果3.1各組大鼠腎組織mda含量比較與正常對照組比較,模型組大鼠腎組織MDA含量顯著升高。與模型組比較,3個治療組大鼠腎組織MDA含量均顯著降低。與腎康丸組比較,厄貝沙坦組腎組織MDA含量無顯著性差異,合用組腎組織MDA含量顯著降低(圖1)。3.2腎組織gsh-px、cat、cu,zn-sod活性檢測與正常對照組比較,模型組大鼠腎組織GSH-Px、CAT與Cu,Zn-SOD活性均顯著降低。與模型組比較,3個治療組大鼠腎組織GSH-Px、CAT與Cu,Zn-SOD活性均顯著升高。與腎康丸組比較,厄貝沙坦組腎組織GSH-Px、CAT與Cu,Zn-SOD活性均無顯著性差異,合用組大鼠腎組織GSH-Px、CAT與Cu,Zn-SOD活性均顯著升高(圖2、3)。3.3腎組織gsh-px、cu,zn-sod及cat表達水平比較與正常對照組比較,模型組大鼠腎組織GSH-Px與Cu,Zn-SOD表達水平均顯著升高,CAT表達水平無顯著性差異。與模型組比較,3個治療組大鼠腎組織GSH-Px與Cu,Zn-SOD表達水平均顯著降低,CAT表達水平無顯著性差異。與腎康丸組比較,厄貝沙坦組大鼠腎組織GSH-Px、CAT與Cu,Zn-SOD表達水平均無顯著性差異;合用組大鼠腎組織GSH-Px與Cu,Zn-SOD活性均顯著降低,CAT表達水平無顯著性差異(圖4～7)。4腎康丸對dn大鼠腎組織中cu,gsh-px、cat活性的影響B(tài)rownlee提出的DM并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學(xué)說認為,高血糖通過多元醇、蛋白激酶C、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和己糖胺導(dǎo)致DN等DM微血管病變并發(fā)癥的4種途徑均可能系在高血糖環(huán)境下,活性氧(ROS)生成過多導(dǎo)致組織細胞中發(fā)生氧化應(yīng)激的結(jié)果。關(guān)于抗氧化酶系統(tǒng)(主要包括Cu,Zn-SOD、CAT和GSH-Px)的活性在DM腎組織中變化的研究較多,但至今尚無統(tǒng)一結(jié)論。有研究報道在DM大鼠成模3w時,腎組織內(nèi)SOD及GSH-Px活性較對照組顯著升高,而CAT活性與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。目前比較傾向的看法是:在DM早期,腎組織內(nèi)部分抗氧化酶的活性代償性增高,而隨著DM病程的延長,其活性逐漸下降,最終導(dǎo)致了腎組織內(nèi)OS的發(fā)生。本實驗中筆者也發(fā)現(xiàn),與對照組比較,DN模型組大鼠腎組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著增加,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低,表明DN大鼠體內(nèi)ROS增多,機體清除ROS的能力下降,OS明顯增高。SOD和GSH-Px、CAT的主要作用分別是清除超氧陰離子(O-·2)和過氧化氫(H2O2)。在本實驗中,DN模型組大鼠腎組織中Cu,Zn-SOD、GSH-Px、CAT活性下降并不是腎組織中的(O-·2)和H2O2生成減少,更可能的原因是由于OS產(chǎn)物對酶活性的抑制作用和酶活性基團的糖基化所引起。腎組織中Cu,Zn-SOD、GSH-PxmRNA表達水平升高,但其酶的活性反而下降,說明由于DM引起的OS異常,反饋性地升高Cu,Zn-SOD、GSH-PxmRNA的表達水平,因而其酶活性下降更可能的原因是酶蛋白活性基團受抑。DN模型組大鼠腎組織中CAT活性下降而其mRNA表達水平卻與正常對照組無顯著性差異,可能是由于腎組織中CAT的表達甚少所致。由此可見,DM時不斷升高的血糖促進ROS的產(chǎn)生,加重酶活性基團的糖基化,抑制抗氧化酶的活性,而抗氧化酶的活性下降又加重了ROS的生成,形成惡性循環(huán)。DN時活性增高的血管緊張素(Ang)Ⅱ誘發(fā)了OS的發(fā)生,而ROS不但作為AngⅡ的信號分子執(zhí)行了其細胞毒性作用,并且參與了高糖誘導(dǎo)的腎臟局部AngⅡ的上調(diào)。Barnett等觀察了Ang轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和AngⅡ受體拮抗劑(ARB)對DM大鼠腎組織內(nèi)OS的影響,發(fā)現(xiàn)ACEI和ARB均減輕了腎組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng),而上調(diào)了酶性抗氧化分子的活性,證實了ACEI和ARB的抗氧化作用。本實驗中筆者也發(fā)現(xiàn),應(yīng)用ARB制劑厄貝沙坦干預(yù)后,DN大鼠腎組織中MDA含量顯著減少,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性顯著增高,SOD、GSH-PxmRNA表達水平下降,表明厄貝沙坦可減少ROS的生成,抑制機體的OS反應(yīng)。本實驗中筆者發(fā)現(xiàn),應(yīng)用腎康丸干預(yù)后,DN大鼠腎組織中MDA含量顯著減少、抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性顯著增高,SOD、GSH-PxmRNA表達水平下降,與厄貝沙坦組比較均無顯著性差異,表明腎康丸減少DN時ROS的生成、抑制OS的作用與ARB制劑厄貝沙坦大致相當。而與腎康丸組、厄貝沙坦組比較,腎康丸和厄貝沙坦合用組上述指標均有顯著性差異,表明腎康丸與厄貝沙坦對DN大鼠的OS具有協(xié)同抑制作用。腎康丸減少DN時ROS生成、抑制OS作用的可能機制包括:(1)現(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實,腎康丸組方中的黃芪、金櫻子、水蛭、玉米須、益母草等均可通過降低脂質(zhì)過氧化物含量、提高抗氧化酶活性而減輕ROS對機體的損傷,具有一定的抗OS作用。(2)腎康丸組方中的黃芪、金櫻子、水蛭、玉米須均具有一定的降糖作用,不但可減少DN時因葡萄糖自身氧化作用增加而產(chǎn)生的大量ROS,而且還可通過抑制高糖誘導(dǎo)的腎臟局