單側(cè)輸尿管粘結(jié)與單側(cè)輸尿管粘結(jié)再通大鼠腎纖維化模型的比較

單側(cè)輸尿管粘結(jié)與單側(cè)輸尿管粘結(jié)再通大鼠腎纖維化模型的比較

作為古典的腎間質(zhì)纖維動(dòng)物模型，一側(cè)管孔模型被學(xué)術(shù)界所證明。但是UUO模型只能觀察梗阻后腎組織的組織形態(tài)學(xué)變化,對(duì)于受損腎臟的功能難以評(píng)價(jià),和臨床實(shí)際遇到的輸尿管梗阻以及不全梗阻患者治療后解除梗阻后功能恢復(fù)以及病理形態(tài)好轉(zhuǎn)的情況不相符合,鑒于此,建立一種既能觀察梗阻后腎臟病理形態(tài)學(xué)變化又能研究其功能水平以及體現(xiàn)這二者之間的聯(lián)系的新模型,為臨床研發(fā)治療腎纖維化藥物提供新的研究對(duì)象顯得尤為必要。通過(guò)反復(fù)研究和實(shí)踐我們發(fā)明了單側(cè)輸尿管彈性塑膠加壓結(jié)扎再通模型(獲國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利號(hào):200910057757.3),進(jìn)一步發(fā)展和完善了研究腎小管間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型。1材料和方法1.1動(dòng)物中心提供健康SPF級(jí)雄性SD大鼠54只,體重200±20g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)0058668)。分籠飼養(yǎng)于12h光照,相對(duì)濕度45%左右的飼養(yǎng)籠中,動(dòng)物自由飲水、攝食,室溫喂養(yǎng)。彈性塑膠管由PVC材料自行制作,上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心為標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2術(shù)后大鼠的情況觀察54只SPF級(jí)SD雄性大鼠,其中18只作為再通組(A組);18只接受經(jīng)典單側(cè)輸尿管結(jié)扎造成UUO模型(B組);另18只為假手術(shù)組(C組)。再通組在接受左輸尿管植入彈性管脂肪墊加壓結(jié)扎梗阻后第7日后接受第二次手術(shù),在第二次手術(shù)中,取出植入彈性管,疏通左側(cè)輸尿管,從而解除左腎梗阻,同時(shí)將右腎包膜分離,4號(hào)線結(jié)扎右側(cè)輸尿管。術(shù)后記錄大鼠的生存狀況、尿量。分別于術(shù)后第7和14日、21日各處死6只再通組大鼠、6只UUO組大鼠和6只假手術(shù)組大鼠,通過(guò)腹主動(dòng)脈取血,監(jiān)測(cè)腎功能水平,尿NAG,從而了解左腎功能,動(dòng)態(tài)觀察腎組織形態(tài)的改變。所有大鼠處死后取出左腎,去處包膜后縱行切開腎臟,進(jìn)行腎臟大小、腎實(shí)質(zhì)厚度測(cè)量,一部分腎組織固定后行病理檢查、免疫組化染色(α平滑肌動(dòng)蛋白)。1.3建立模型的評(píng)估方法1.3.1評(píng)估指標(biāo)1.3.1.1.腎功能測(cè)試血肌酐、尿素氮用常規(guī)生化測(cè)定方法檢測(cè)。1.3.1.尿nag含量測(cè)定尿NAG的測(cè)定:選用上海亞都生物技術(shù)經(jīng)營(yíng)部提供的尿NAG含量測(cè)定試劑盒,采用ELISA法,用酶標(biāo)儀測(cè)定,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,步驟略。1.3.1.3.大鼠腎臟病理檢查用MASSION染色,觀察腎小球、腎小管和間質(zhì)的病理變化。1.3.1.4.免疫組染色α平滑肌動(dòng)蛋白,采用SABC法。1.3.1.腎間質(zhì)纖維化指數(shù)腎組織Masson特染,光鏡觀察。在PAS-9000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)下計(jì)算腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)。高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取6個(gè)不重疊視野測(cè)定小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比,進(jìn)行半定量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分:無(wú)病變;1分:<25%;2分:26%~50%;3分:>50%。每張切片取6個(gè)視野的平均積分,再在各組取平均值。1.3.2免疫組化陽(yáng)性信號(hào)分析在每張切片不包含腎小球和血管的間質(zhì)區(qū)域隨機(jī)選取20個(gè)高倍鏡視野(×200,HPF),用PAS-9000高清晰彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)對(duì)所選取視野中免疫組化陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析,計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性染色面積占總視野面積的百分比,并計(jì)算其均值即平均面密度。1.4量資料組間比較測(cè)定數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示;計(jì)量資料組間比較采用One-wayANOVAtest。所有數(shù)據(jù)在SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1肌肉注射給予大鼠scr比較造模14d后UUO組和再通組的肌酐、尿素氮都顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),說(shuō)明造模成功,并且再通組和UUO組Scr比較具有顯著差異(P<0.05)。造模21d后UUO組和再通組的肌酐、尿素氮都顯著高于假手術(shù)組(P<0.01);同時(shí)再通組與UUO組相比有明顯下降趨勢(shì),并且再通組和UUO組Scr比較具有顯著差異(P<0.05),造模28d后UUO組和再通組的肌酐、尿素氮都顯著高于假手術(shù)組(P<0.01);同時(shí)與UUO組28d后相比再通組肌酐、尿素氮有明顯下降趨勢(shì)(P<0.01),說(shuō)明再通造模成功對(duì)腎功能恢復(fù)的優(yōu)勢(shì)(表1)。2.2尿nag的變化再通組的尿NAG呈動(dòng)態(tài)變化,隨著再通時(shí)間的增加,尿NAG排出逐漸減少,證明腎小管功能的逐步恢復(fù),而UUO組的尿NAG逐步增高,證明腎小管功能在逐步惡化加重。再通組分別與UUO組14、21、28d比較尿NAG都差異顯著(P<0.01)。證明再通組更有利于腎小管功能恢復(fù)(表2)。2.3腎纖維化指數(shù)下降,腎纖維化程度減弱UUO組和再通組和假手術(shù)組比較均差異極顯著(P<0.01)。隨著再通7d、14d、21d模型組腎纖維化指數(shù)逐漸減低,纖維化程度逐漸減輕,14d和UUO組比較雖有差別,但差異不顯著,21d和UUO組比較差異顯著(P<0.05),28d和UUO組比較差異極顯著(P<0.01)。說(shuō)明隨著梗阻解除再通組的腎臟病理有明顯的好轉(zhuǎn),且與腎小球和腎小管的功能恢復(fù)相一致(表3)。2.4腎組織病理學(xué)表現(xiàn)造模14d、21d和28d后UUO和再通組的α-SMA顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),說(shuō)明腎組織有顯著的纖維化表現(xiàn)。而在再通造模14d、21d和28d后和UUO組比較α-SMA有顯著下降(P<0.01)(表4)。2.5腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸漬假手術(shù)組,Masson染色顯示腎小管間質(zhì)未見明顯病變(圖1,圖2)。UUO術(shù)后第14天,Masson染色顯示腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),主要為單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,腎間質(zhì)水腫,部分小管消失,集合管,遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀,管腔內(nèi)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞,遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張,間質(zhì)纖維化輕(圖3)。再通組術(shù)后14d,Masson染色顯示部分近端小管保存尚好,腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)但是較UUO模型組明顯減少。部分近端腎小管擴(kuò)張程度輕,部分集合管,遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀但未見小管空泡變性,纖維化程度較UUO組術(shù)后14d輕(圖4)。UUO術(shù)后第21天,Masson染色顯示腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),主要為單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,腎間質(zhì)水腫,部分近端小管擴(kuò)張,管腔內(nèi)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞,遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張,中度腎間質(zhì)纖維化(圖5)。再通組術(shù)后21d,Masson染色顯示部分近端小管上皮細(xì)胞空泡變性,管腔內(nèi)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞,未見小管萎縮消失,集合管,遠(yuǎn)曲小管病變程度較輕,腎間質(zhì)纖維化輕(圖6)。UUO術(shù)后第28天,Masson染色顯示片狀分布的腎小管萎縮和擴(kuò)張,損傷萎縮腎小管周圍見到代償性肥厚擴(kuò)張的腎小管,腎小管出現(xiàn)動(dòng)脈硬化樣改變和不同程度的腎間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)。部分小管萎縮消失,重度腎間質(zhì)纖維化(圖7)。再通組術(shù)后28d,Masson染色顯示部分近端小管保存尚好,未見遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張,未見腎小管空泡變性,腎間質(zhì)纖維化程度較輕(圖8)。2.6uui組-sma的表達(dá)程度α-SMA免疫組化染色見陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色,陰性對(duì)照組未見棕黃色顆粒在腎小管間質(zhì)的沉積(圖9,圖10)。UUO組α-SMA在14d時(shí),在腎小管間質(zhì)有明顯棕黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá),隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng),UUO組α-SMA在21d和28d時(shí)棕黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá)逐漸增多,表達(dá)部位主要在腎小管間質(zhì)(圖11、圖13、圖15)。在各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上,RUUO組棕黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá)逐漸減少(圖12、圖14、圖16)。RUUO組α-SMA的表達(dá)較UUO組輕,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01)。3腎組織病理變化臨床中因?yàn)檩斈蚬芄Ｗ杌蛘卟蝗Ｗ鑼?dǎo)致的腎纖維化時(shí)有發(fā)生,然而對(duì)于腎纖維化的治療至今缺乏有效的辦法。同時(shí)目前的研究已證實(shí),腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能減退的相關(guān)性比腎小球病變與腎功能減退相關(guān)性更為密切。單側(cè)輸尿管節(jié)扎(UUO)模型制作相對(duì)簡(jiǎn)單,有較好的重復(fù)性,腎間質(zhì)纖維化發(fā)生迅速,是目前公認(rèn)的研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制,腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的理想模型,但是由于梗阻導(dǎo)致腎纖維化的不可逆性,所以觀察藥物干預(yù)治療效果就存在較大的局限性。而單側(cè)輸尿管彈性塑膠加壓結(jié)扎以及再通模型既能觀察梗阻后腎臟病理形態(tài)學(xué)變化又能研究其功能水平以及體現(xiàn)這二者之間的聯(lián)系的新模型,為臨床研發(fā)預(yù)防和治療腎纖維化藥物提供新的研究對(duì)象。單側(cè)輸尿管梗阻后,腎實(shí)質(zhì)受壓,局部血流量降低,使腎小管缺血,變性,萎縮,甚至消失。損傷的腎小管又是多種炎癥和促纖維化因子的主要來(lái)源,促進(jìn)和加重了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)行UUO術(shù)后第7天,梗阻側(cè)腎組織即出現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)水腫,部分近端小管上皮細(xì)胞空泡變性,管腔內(nèi)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞,遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張。第14天,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及增殖更為明顯,部分小管消失,集合管,遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀,皮質(zhì)變薄,出現(xiàn)間質(zhì)纖維化。第21天,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞增殖,皮髓質(zhì)變薄,間質(zhì)纖維化進(jìn)一步加重。第28天,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少,皮質(zhì)極薄,部分小管萎縮消失,纖維化顯著,而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中腎小球病變均不明顯。進(jìn)行腎小管損害程度及腎間質(zhì)纖維化定量分析顯示:隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng),腎小管損害的比率及腎間質(zhì)纖維化程度呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)加重的過(guò)程。而再通組則和UUO相反,呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)好轉(zhuǎn)的過(guò)程。觀察UUO術(shù)后梗阻側(cè)腎臟外觀發(fā)現(xiàn),隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng),UUO組梗阻側(cè)腎臟顯著增大腫脹,出現(xiàn)嚴(yán)重積水,表面不平,灰紅相間,包膜顯著增厚,而在再通組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上,再通側(cè)腎臟腫大及積水程度較輕,色澤較紅潤(rùn),說(shuō)明再通可以改善梗阻腎積水及腫脹程度。術(shù)后第14天,由于梗阻后的早中期病變是以炎性細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)水腫,小管擴(kuò)張為主(圖3)。再通組病變較輕(圖4)。UUO術(shù)后第21~28天,隨著腎盂積水的加重,腎實(shí)質(zhì)逐漸變薄,間質(zhì)纖維化加重(圖5,圖7)。再通組腎盂積水的減輕,腎實(shí)質(zhì)逐漸變厚,間質(zhì)纖維化逐漸恢復(fù)(圖6,圖8)。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異。手術(shù)后第14天UUO組的血尿素氮、肌酐值開始升高,第21~28天,血尿素氮、肌酐值反而下降并基本恢復(fù)正常,這可能與尿路梗阻后引起腎小球囊內(nèi)壓增高,腎臟局部血流動(dòng)力學(xué)紊亂,導(dǎo)致腎小球慮過(guò)率下降有關(guān),并提示急性單側(cè)輸尿管梗阻后,大鼠腎功能有一個(gè)急性失代償逐漸過(guò)渡到對(duì)側(cè)腎臟代償?shù)倪^(guò)程。而再通組腎功能呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)好轉(zhuǎn)的過(guò)程。提示7d造成的早中期腎纖維化是可以部分逆轉(zhuǎn)的。由于本模型研制成功為進(jìn)一步研究腎纖維化逆轉(zhuǎn)時(shí)間窗口進(jìn)行有效的藥物干預(yù)或找到不可逆轉(zhuǎn)的腎纖維化時(shí)間點(diǎn)成為可能。UUO術(shù)后梗阻側(cè)腎臟出現(xiàn)了一系列病理變化。UUO組腎小管間質(zhì)纖維化損害隨著時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸纖維化,直到終末期。再通組在各時(shí)間點(diǎn)的腎小管損害和間質(zhì)纖維化程度要顯著低于UUO組,再通組腎小管間質(zhì)纖維化損害隨著時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸好轉(zhuǎn)。說(shuō)明再通組能改善輸尿管梗阻后的小管間質(zhì)損害,和UUO組比較呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)好轉(zhuǎn)的過(guò)程。在UUO模型中,腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞迅速增殖,部分腎小管上皮細(xì)胞還可發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生大量α平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)。本研究免疫組化顯示:兩組相比,UUO組α-SMA