糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激及pgc-lmrna表達(dá)的變化

糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激及pgc-lmrna表達(dá)的變化

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最重要的微血管并發(fā)癥之一。也是腎衰竭和患者死亡的重要原因之一。研究已表明,因高血糖誘發(fā)氧化應(yīng)激,體內(nèi)活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)生異常增多是導(dǎo)致包括DN在內(nèi)的糖尿病血管并發(fā)癥的重要原因。線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS產(chǎn)生的重要來源,這可能與高血糖狀態(tài)下線粒體功能紊亂有關(guān),線粒體在DN發(fā)生和發(fā)展中作用機(jī)制目前未完全闡明。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisomeproliferators-activatedreceptorγcoactivator-1α,PGC-1α)是多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子,在調(diào)控糖脂和能量代謝方面發(fā)揮重要作用,其中調(diào)節(jié)線粒體的生物合成和氧化代謝是其主要功能之一。有關(guān)DN與線粒體及PGC-1α關(guān)系的研究目前仍很少涉及。本研究觀察DN大鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激及PGC-lαmRNA表達(dá)變化,初步探討DN與線粒體功能及PGC-1α的關(guān)系。1材料和方法1.1malusialdhs鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),(Sigma公司);微量血糖測定儀及血糖試紙(瑞士羅氏公司);琥珀酸脫氫酶(succinodehydrogenase,SDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),儀器用721分光光度計(jì);美國貝克曼公司生產(chǎn)的LX-20全自動(dòng)生化分析儀;RNAstore樣品保存液,總RNAsimple提取試劑盒(離心柱型)、QuantcDNA第1鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒RealMasterMix(SYBRGreen)(北京天根生物),熒光定量PCR儀器用ABI的7500型。PGC-1α和β-actin引物由Invitrogen公司協(xié)助設(shè)計(jì)、合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2大鼠糖尿病dm及血糖穩(wěn)定等指標(biāo)檢測大鼠血糖220~250g雄性Wistar大鼠26只(SPF級(jí))及其正常飼料和高脂高能量飼料(廣西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)選20只大鼠予高脂高能量飼料喂養(yǎng);另設(shè)正常對照(NC)組(n=6),予普通飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物自由攝食和飲水,8周后,高脂高能量飼料飼養(yǎng)大鼠給予小劑量鏈脲佐菌素(25mg/kg)腹腔注射(將STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液中,pH4.5,大鼠注射STZ前禁食12h),正常對照組注射等量的檸檬酸緩沖液,72h后剪尾端取血測末梢血血糖,以≥16.7mmol/L為高血糖大鼠,高血糖大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高脂高能量飼料,此后每3天檢測血糖1次,取穩(wěn)定血糖≥16.7mmol/L者進(jìn)入糖尿病組,最后一直穩(wěn)定成模并成功入組糖尿病(DM)組11只。糖尿病組大鼠連續(xù)3次測尿白蛋白/尿肌酐(Alb/Cr)為30~300mg/g,診斷為早期腎病。1.3大鼠腎皮質(zhì)檢測指標(biāo)以STZ制模后第8周始各組用代謝籠收集尿液,連續(xù)3d,每天1次,每次收集6h尿,測尿白蛋白/尿肌酐,尿白蛋白采用免疫比濁法測定,尿肌酐用酶法測定。間隔4周后重復(fù)上述方法,至第28周時(shí)糖尿病組有7只連續(xù)3d尿白蛋白/尿肌酐達(dá)30~300mg/g。6只NC組大鼠和7只DN大鼠均禁食12h,以10%水合氯醛1.0mL腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血,測生化指標(biāo);取0.3g腎皮質(zhì),待測SDH、MDA和SOD;另取約100mg腎皮質(zhì)放入1mL的RNA保護(hù)液中,立即剪碎成約1.0mm×1.0mm×1.0mm組織碎塊后移入-80℃冰箱,待提取總RNA。1.4生化指標(biāo)的檢測Beckman自動(dòng)生化分析儀測定血糖(BG)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)。1.5sdh和sod活性的測定0.3g腎皮質(zhì)迅速移入預(yù)加2.5mL冰生理鹽水5.0mL玻璃勻漿器,冰浴中制成10%勻漿,勻漿液4℃、5000g離心10min,取上清,后續(xù)測定按試劑盒說明書要求,采用化學(xué)比色法測定SDH和SOD活性及MDA含量。1.6實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測pgc-1mr-na表達(dá)1.6.1od20/od280范圍嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。腎提取總RNA后紫外光分光光度計(jì)測量OD260/OD280比值和濃度,要求OD260/OD280為1.8~2.0。取1μgRNA,以oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,選擇10μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:37℃60min。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.6.2目的基因pgc-1上引物gccactacacacctct的表達(dá)引物設(shè)計(jì)參照NCBI的mRNA全長序列(PGC-1α序列號(hào)NM_031347.1;β-actin序列號(hào)NM_031144.2),目的基因PGC-1α上游引物GCCACTACAGACACCGCAC,下游引物CCTTTCAGACTCCCGCTTC,預(yù)期產(chǎn)物長度167bp;內(nèi)參基因β-actin上游引物CGTTGACATCCGTAAAGACC,下游引物AGCCACCAATCCACACAGAGTA,預(yù)期產(chǎn)物長度173bp。1.6.3實(shí)時(shí)定量pcr檢測pgc-l和內(nèi)生基因選一任意正常對照腎的cD-NA作為標(biāo)準(zhǔn)品,按l︰10倍比稀釋成6個(gè)梯度(105、104、103、102、101和100),分別進(jìn)行目的基因PGC-lα及內(nèi)參基因β-actin的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),制備兩基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6.4-actin反應(yīng)條件選擇20μL體系。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔,目的基因和內(nèi)參基因均設(shè)空白對照。PGC-lα反應(yīng)條件:95℃2min預(yù)變性,94℃30s→52℃45s→68℃1min,40個(gè)循環(huán);β-actin反應(yīng)條件:95℃2min預(yù)變性,94℃30s→55℃45s→68℃1min,40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)信息資料被ABI7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀收集并儲(chǔ)存于其附件電腦含相應(yīng)的分析軟件中。1.6.5單次給藥后多選擇陽性者多為多重復(fù)瓊脂糖凝膠電泳和溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。融解曲線設(shè)置:95℃15s,60℃1min,以0.3℃/s緩慢升溫至95℃,升溫時(shí)連續(xù)收集熒光信號(hào)。1.6.6ratio的計(jì)算相對定量采用Pfafll法進(jìn)行分析,計(jì)算公式如下:Ratio=E靶基因△CT靶基因(對照組一實(shí)驗(yàn)組)/E內(nèi)參基因△CT內(nèi)參基因(對照組一實(shí)驗(yàn)組)。1.7統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩組均數(shù)之間比較的t檢驗(yàn),以P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果2.1尿白蛋白/尿心肌肌注射法檢測dn早期大鼠尿白蛋白/尿胱肌注射下大鼠尿白蛋白/尿胱肌肉注射.正常對照期和DN早期尿白蛋白/尿肌酐分別為(24.6±3.3)mg/g和(171.3±25.7)mg/g,與正常對照期比較,DN早期大鼠尿白蛋白/尿肌酐比較顯著升高,差異有顯著性(P<0.05)。2.2初步dn組n.7與rci組n.6之間的血生生物化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了比較表1結(jié)果顯示,與NC組比較,早期DN組的血糖顯著升高(P<0.05);而BUN和Cr在兩組間差異無顯著性(P>0.05)。2.3兩組腎皮質(zhì)sdh、sod和sda的比較與NC組比較,DN組腎皮質(zhì)SDH和SOD活性明顯下降,而MDA含量明顯升高,差異有顯著性(P<0.05)。見表2。2.4兩組均腎皮質(zhì)pgc-1mrna2.4.1in標(biāo)準(zhǔn)曲線目的基因PGC-1α及內(nèi)參基因β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線,斜率分別為-3.283和-3.562;相關(guān)系數(shù)分別為0.9995和0.9941,相關(guān)性良好,定量結(jié)果可信。2.4.2溶解曲線與峰形溶解曲線分析顯示目的基因PCR產(chǎn)物的溶解曲線峰值在86.6℃。溶解溫度均一,峰的形狀較為銳利(圖1);內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的溶解曲線的峰值在85.4℃,峰形銳利(圖2);瓊脂糖凝膠電泳顯示所得的產(chǎn)物為單一目的條帶,擴(kuò)增片段與理論大小一致。3糖尿病大鼠腎皮質(zhì)抗氧化活性變化DN是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥,是影響糖尿病患者預(yù)后的主要因素之一。長期高血糖是DN發(fā)生的最關(guān)鍵原因,高血糖造成腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變以及葡萄糖本身代謝異常所致的一系列后果是造成腎臟病變的基礎(chǔ),其中葡萄糖代謝異常對DN病變的作用主要通過促進(jìn)蛋白的非酶糖基化、多元醇通路的激活、蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)和己糖胺代謝途徑的激活。在上述諸種發(fā)病機(jī)制中,目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是重要的共同機(jī)制。氧化應(yīng)激是指ROS產(chǎn)生增多,同時(shí)機(jī)體抗氧化防御能力下降,從而引起氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致ROS在體內(nèi)蓄積而引起的分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷。ROS可與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA,其含量可間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度;而SOD是ROS清除的重要抗氧化劑,其活性高低反映機(jī)體的抗氧化能力。在本實(shí)驗(yàn)中筆者通過檢測MDA含量和SOD活性來評價(jià)DN大鼠的氧化應(yīng)激水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組比較,DN大鼠腎皮質(zhì)MDA含量明顯增加而SOD活性顯著下降,本結(jié)果也印證了氧化應(yīng)激與DN發(fā)生有密切關(guān)系的觀點(diǎn)。糖尿病時(shí)腎臟氧化應(yīng)激損傷與高血糖誘發(fā)線粒體功能的障礙有關(guān)。高血糖毒性作用引發(fā)線粒體電子傳遞和氧化磷酸化途徑發(fā)生障礙,產(chǎn)生的大量電子供體,明顯增加線粒體膜內(nèi)外電化學(xué)勢能,形成超極化,通過輔酶Q的電子傳遞使氧分子還原,產(chǎn)生大量的ROS;此外糖代謝異常也導(dǎo)致糖尿病鼠腎臟的SOD等抗氧化物水平降低,抗氧化能力下降,其結(jié)果是作用于腎臟的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡,造成氧化應(yīng)激。SDH是位于線粒體內(nèi)膜上呼吸鏈的關(guān)鍵酶之一,其可作為反映線粒體功能的敏感指標(biāo)。PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子核呼吸因子1(NF1)、核呼吸因子2(NF2)的共激活因子,在細(xì)胞信號(hào)作用下與轉(zhuǎn)錄子結(jié)合,上調(diào)線粒體和呼吸鏈基因的表達(dá)。PGC-1α的主要生物學(xué)功能之一是刺激線粒體生物合成及在不同組織中增強(qiáng)氧化代謝功能。因此,它也是反映線粒體功能的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,與正常對照組比較,DN大鼠腎皮質(zhì)SDH活性下降;PGC-1αmRNA表達(dá)降低,結(jié)果表明,DN大鼠腎皮質(zhì)存在線粒體功能障礙而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與PGC-1α的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。線粒體是產(chǎn)生ROS的重要器官。PGC-1α能夠激活UCP2和UCP3的表達(dá),從而消除陽離子梯度、降低線粒體膜電位、減少線粒體ROS的生成。此外,當(dāng)PGC-1α刺激線粒體中的呼吸鏈生物合成時(shí)