第2章 基因操作的主要方法和工具-1

第2章

基因操作的主要方法和工具－11.分子生物學(xué)基本知識(shí)1.1基因組（genome）：

生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)的總和,是指生物細(xì)胞中所有的DNA，包括所有的基因和基因間區(qū)域。人的核基因組：30億bp（最新資料說(shuō)28.5億）2～2.5萬(wàn)個(gè)蛋白編碼基因真核生物基因組：核基因組線粒體基因組葉綠體基因組原核生物基因組：染色體質(zhì)粒病毒基因組：病毒顆粒攜帶的遺傳物質(zhì)Zeamays（玉米）8,000Homosapiens3,000Oryzasativa（稻）400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana（擬南芥）100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)什么是C值？通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量.

在真核生物中，C值一般隨著生物的進(jìn)化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。

C值悖理（C-valueparadox)：

生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加細(xì)菌真菌等動(dòng)物陰影部分為一個(gè)門(mén)內(nèi)C-值的范圍近年來(lái)完成的原核生物和真核生物的基因組測(cè)序揭示，在一些最基本的生命特征方面，地球上所有生物可分為三大類(lèi)群，即真細(xì)菌(bacteria)，古細(xì)菌或古生菌(archaea)和真核生物(eukarya)三界(domain)。1.2生命三界1.3基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)突變

系指基因組中小段區(qū)域內(nèi)核苷酸序列的改變。大多數(shù)突變是點(diǎn)突變，即核苷酸序列中某一堿基取代了另一堿基，其他的突變則涉及一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的插入或缺失。2.重組系指染色體或DNA分子之間的交換與重組,涉及染色體區(qū)段或DNA序列之間的新的連鎖關(guān)系。3.轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座是基因組進(jìn)化的一種重要方式，出現(xiàn)在幾乎所有生物類(lèi)型中。其結(jié)果是一段DNA或其拷貝從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一位置,并在插入位點(diǎn)兩側(cè)產(chǎn)生一對(duì)很短的正向重復(fù)序列。轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)1951年，B.McClintock發(fā)現(xiàn)玉米中的Ac-Ds系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子可以分為兩大類(lèi)：DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子：反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)：在結(jié)構(gòu)和復(fù)制上與反轉(zhuǎn)錄病毒類(lèi)似，只是沒(méi)有病毒感染必須的env基因，它通過(guò)轉(zhuǎn)錄合成mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成新的元件整合到基因組中完成轉(zhuǎn)座。兩端具有反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座后靶位點(diǎn)形成正向重復(fù)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移已知的轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座途徑有兩種：復(fù)制轉(zhuǎn)座和非復(fù)制轉(zhuǎn)座。復(fù)制轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)座期間先復(fù)制一份拷貝，而后拷貝轉(zhuǎn)座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原來(lái)的轉(zhuǎn)座因子。非復(fù)制轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子直接從原來(lái)位置上轉(zhuǎn)座插入新的位置，并留在插入位置上，結(jié)果是在原來(lái)的位置上丟失了轉(zhuǎn)座因子，而在插入位置上增加了轉(zhuǎn)座因子。1.4新基因產(chǎn)生的主要方式：①基因加倍之后的趨異，這類(lèi)基因基本保持原有的基因功能,但往往獲得了新的表達(dá)模式,這是新基因產(chǎn)生的主要方式。酵母基因組在1億年前經(jīng)歷了一次完全的加倍②外顯子或結(jié)構(gòu)域洗牌（domainshufflingorexonshuffling):功能域或外顯子洗牌由不同基因中編碼不同結(jié)構(gòu)域的片段彼此連接形成的全新編碼序列。它們有一個(gè)全新的結(jié)構(gòu)組合，可為細(xì)胞提供完全不同的生物學(xué)功能。不同的結(jié)構(gòu)域加倍或重組,產(chǎn)生具有創(chuàng)新功能的基因.真核生物約19％的基因產(chǎn)生于外顯子洗牌。③可移動(dòng)元件的轉(zhuǎn)座和逆轉(zhuǎn)座。④外源基因水平轉(zhuǎn)移。

原核生物中DNA的水平轉(zhuǎn)移是一種十分普遍的現(xiàn)象，可通過(guò)接合轉(zhuǎn)移、噬菌體轉(zhuǎn)染、外源DNA的攝取等不同途徑發(fā)生。

大多數(shù)有關(guān)動(dòng)物種間基因轉(zhuǎn)移主要集中在逆轉(zhuǎn)錄病毒及其轉(zhuǎn)座成分。⑤基因裂變(fission)和融合(fusion)，由一個(gè)基因分裂成兩個(gè)不同的基因，或兩個(gè)或多個(gè)基因融合組成一個(gè)新的基因，原核生物約0．5％的基因由此產(chǎn)生。⑥非編碼序列轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a序列。??基因之間的同源性：直系同源（ortholog）：不同物種，同一祖先，功能相同。旁系同源（paralog）：同一物種，復(fù)制產(chǎn)生，功能可能不同。1.5分子鐘單位時(shí)間內(nèi)同源蛋白質(zhì)氨基酸順序或DNA核苷酸序列發(fā)生改變的比率稱為分子鐘，通常以百萬(wàn)年發(fā)生單個(gè)代換為計(jì)算單位，可用于估算祖先序列演化的時(shí)間，確立系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的進(jìn)化年代。2.核酸操作

2.1核酸的分離和檢測(cè)

DNA,RNA——提取、分離與純化——重要的第一步(1)核酸的分離、提取通則核酸在細(xì)胞中通常與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。

分離原則：保證核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；排除其他分子污染。核酸提取一般包括破碎細(xì)胞、酶處理、核酸釋放及與其他細(xì)胞組分分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟。

(1.1)破碎細(xì)胞

機(jī)械作用：低滲、超聲、微波、凍融裂解和顆粒破碎等。不適于高分子量長(zhǎng)鏈核酸的分離?；瘜W(xué)作用：一定pH和變性條件下，細(xì)胞破裂，蛋白變性沉淀，核酸→水相。變性條件：加熱、表面活性劑(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40等)、強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍等)。pH環(huán)境：強(qiáng)堿(NaOH)或緩沖液(TE、STE等)。

金屬離子螯合劑(EDTA等)螯合Mg2+

、Ca2+，抑制核酸酶活性。酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶)破裂細(xì)胞。降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。聯(lián)合使用：細(xì)胞、待分離核酸類(lèi)型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)俊?/p>

(1.2)酶處理

裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K或鏈酶蛋白酶）

，降解蛋白質(zhì)；滅活核酸酶（DNase和RNase）加入DNase和RNase去除不需要的核酸。

(1.3)核酸的分離與純化

高電荷磷酸骨架比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性。根據(jù)理化性質(zhì)差異，選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法。

①酚提取/沉淀法

經(jīng)典方法是酚:氯仿抽提法。裂解細(xì)胞；等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1體積)混合液抽提；離心分離；疏水性的蛋白質(zhì)→有機(jī)相，核酸→上層水相。緩沖液飽和酚——蛋白變性；氯仿增加有機(jī)相比重，防止酚流入水相；異戊醇可減少操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡，下層的界面更清晰

。

核酸鹽經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀濃縮含核酸的水相在pH5.0～5.5，終濃度0.2～0.3MNaAc或KAc（鈉離子中和核酸磷酸骨架負(fù)電荷，在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸疏水復(fù)性），加2～2.5倍體積乙醇或異丙醇，沉淀核酸。DNA沉淀用乙醇洗滌，再用水或TE緩沖液溶解。進(jìn)一步純化——氯化銫梯度密度離心、透析、凝膠排阻層析②層析法

利用待分離核酸與其他組分的物質(zhì)與理化性質(zhì)差異建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等。商品試劑盒，分離和純化同步進(jìn)行。核酸質(zhì)量好、產(chǎn)量高、成本低、快速、簡(jiǎn)便、節(jié)省人力以及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

親和層析法分離mRNA全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)

RocheMagNAPure96

MagNAPureLC2.0(2)核酸定量

ug（10-6）、ng（10－9）、pg（10－12）紫外吸收法中DNA或RNA的定量A260=1.0相當(dāng)于:50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸分光光度計(jì)Biophotometer

ThermoScientificNanoDrop2000c

(March2,2009)

（3）核酸質(zhì)量鑒定A260/A280DNA純品:A260/A280=1.8，>1.8RNA污染，<1.8蛋白污染RNA純品:A260/A280=2.0電泳28s18s5s（4）

核酸的凝膠電泳

當(dāng)前核酸研究中最常用的方法，常用于檢測(cè)核酸的分子量、純度、結(jié)構(gòu)變化、序列分析等

種類(lèi)：瓊脂糖凝膠電泳（水平電泳）聚丙烯酰胺凝膠電泳（垂直電泳，

分辨率可達(dá)1bp常用于測(cè)序）涌動(dòng)率決定因素：分子大小，空間構(gòu)型，電荷數(shù)。涌動(dòng)方向PAGEOC：open－coiledL：lineSC：supercoiled（5）

核酸樣品的保存

DNA：DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；

長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。RNA：

RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;

長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;

在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。(6)核酸的檢測(cè)PCR：常規(guī)PCR、RT-PCR、熒光定量PCR雜交：膜雜交（SouthernBlot、NorthenBlot）、組織樣品原位雜交核酸雜交SouthernBlot——DNA

膜雜交NorthernBlot——RNAWesternBlot——Protein

組織切片雜交InsituHybridization——DNA/RNAImmunohistochemistry——Protein主要雜交模式：①核酸的膜雜交

原理：核酸變性和復(fù)性雜交在膜上進(jìn)行——核酸印跡雜交

分類(lèi)：DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Northernblot）

核酸雜交的基本過(guò)程制備樣品待檢測(cè)組織樣品：動(dòng)、植物器官、組織，培養(yǎng)細(xì)

胞，細(xì)菌，病毒等核酸：分離提取DNA（RNA）酶切：限制性內(nèi)切酶消化DNA

電泳：凝膠電泳分離酶切DNA混合物DNA變性：獲得單鏈DNA

轉(zhuǎn)膜

：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到支持膜上(硝酸纖維素膜、

尼龍膜)

探針（probe）:

互補(bǔ)于靶基因順序的單鏈DNA或RNA片段，通常帶有標(biāo)記物如：放射性同位素、熒光化合物或半抗原地高辛等，以檢測(cè)目的基因。

C.雜

交

D.漂洗、檢測(cè)×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析SouthernBlot：檢測(cè)DNA，基因的有無(wú)