第2章 純培養(yǎng)與顯微技術(shù)

第二章純培養(yǎng)與顯微技術(shù)微生物的分離和純培養(yǎng)

1.無(wú)菌技術(shù)

2.用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

3.用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

4.單細(xì)胞（孢子）分離

5.選擇培養(yǎng)分離

6.二元培養(yǎng)物顯微鏡和顯微技術(shù)

1.顯微鏡的種類及原理

2.顯微觀察樣品的制備微生物個(gè)體：小利用群體研究屬性群體形式繁衍、保存人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)繁殖得到的微生物群體為培養(yǎng)物培養(yǎng)物純培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物純培養(yǎng)能較好地得到重復(fù)結(jié)果，是微生物研究的重要技術(shù)之一顯微技術(shù)是微生物研究的另一項(xiàng)重要技術(shù)個(gè)體小一、微生物的分離和純培養(yǎng)無(wú)菌技術(shù)（aseptictechnique)

分離、轉(zhuǎn)接、純化時(shí)防止其他微生物污染的技術(shù)試管、燒瓶、培養(yǎng)皿等常用器皿滅菌方法有：高壓蒸汽滅菌、高溫干熱、煮沸一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物培養(yǎng)常用器皿及滅菌接種針或接種環(huán)分離或?qū)⑽⑸飶囊粋€(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)，無(wú)菌操作?；鹧媾赃叀⒊瑑襞_(tái)或無(wú)菌室進(jìn)行。接種環(huán)采用迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金制備液體培養(yǎng)物用無(wú)菌移液管或移液器一、微生物的分離和純培養(yǎng)接種操作，最基本技術(shù)一、微生物的分離和純培養(yǎng)超凈臺(tái)火焰旁無(wú)菌區(qū)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)各種菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)菌落(colony)：?jiǎn)蝹€(gè)微生物在固體培養(yǎng)基或內(nèi)層）生長(zhǎng)繁殖形成肉眼可見(jiàn)的，有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體。菌落連成片為菌苔（lawn）一、微生物的分離和純培養(yǎng)不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征（形狀、顏色等），是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。一、微生物的分離和純培養(yǎng)同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)克?。╟lone)：一個(gè)單細(xì)胞繁殖形成的菌落，即一個(gè)純種細(xì)胞群或克隆。固體培養(yǎng)基：瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基。平板：即培養(yǎng)平板（cultureplate)。融化的固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿冷卻凝固后即為平板，用于分離、培養(yǎng)微生物。一、微生物的分離和純培養(yǎng)稀釋平板法（pourplatemethod)

將細(xì)菌或其他微生物無(wú)菌水梯度稀釋，取少量與冷卻至50℃固體培養(yǎng)基混合，搖勻，倒入培養(yǎng)皿，凝固，倒置培養(yǎng)24小時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)菌落。一、微生物的分離和純培養(yǎng)常用固體分離純培養(yǎng)方法：一、微生物的分離和純培養(yǎng)稀釋平板法涂布平板法（spreadplatemethod)

稀釋平板法因?yàn)榧?xì)菌與50℃培養(yǎng)基混合導(dǎo)致某些熱敏感菌死亡，及好氧菌埋在培養(yǎng)基中缺乏氧氣影響生長(zhǎng)，所以更常用涂布平板法。一、微生物的分離和純培養(yǎng)常用固體分離純培養(yǎng)方法：一、微生物的分離和純培養(yǎng)涂布平板法平板劃線分離法（streakplatemethod）

接種環(huán)沾取少許微生物，在無(wú)菌平板扇形、平行等劃線，隨劃線次數(shù)增加而分散開(kāi)，得到單菌落。平板劃線分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)稀釋搖管法(dilutionshakeculturemethod）厭氧微生物可用此法進(jìn)行純培養(yǎng)分離。操作：盛培養(yǎng)基試管加熱融化，冷卻至50℃，待分離材料用這些試管梯度稀釋，搖勻，冷凝，石蠟封口一、微生物的分離和純培養(yǎng)厭氧微生物分離裝置：一、微生物的分離和純培養(yǎng)厭氧罐厭氧手套箱液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)：一、微生物的分離和純培養(yǎng)有些微生物液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)，原生動(dòng)物、藻類。方法稀釋法：接種物在液體培養(yǎng)基中順序稀釋，高度稀釋，每個(gè)試管中分配不到一個(gè)。若稀釋后同一梯度的平行試管中大多數(shù)（>95％）沒(méi)有，那么有微生物的可能是純培養(yǎng)，否則可能性下降。顯微分離法直接分離單細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)一、微生物的分離和純培養(yǎng)單細(xì)胞（單孢子）顯微分離：稀釋法缺點(diǎn)分離的優(yōu)勢(shì)菌顯微操作儀，專業(yè)程度高對(duì)某微生物生長(zhǎng)需要了解后，設(shè)計(jì)適合其生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基，抑制其他菌生長(zhǎng)，即使該微生物在混雜群體中很少也可分離。一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：選擇培養(yǎng)基直接分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：如：耐高溫菌采用高溫篩選；蛋白酶產(chǎn)生菌加牛奶篩選；抗抗生素可采用加抗生素篩選待分離的微生物生長(zhǎng)，其它微生物的生長(zhǎng)被抑制一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：富集培養(yǎng)特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加從自然界中分離到所需的特定微生物根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出特定已知微生物種類分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物富集培養(yǎng)一、微生物的分離和純培養(yǎng)二元培養(yǎng)物：培養(yǎng)物只含兩種微生物，并有意識(shí)保持兩者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物為二元培養(yǎng)物。如：病毒－－宿主，原生動(dòng)物－－細(xì)小微生物一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：為何保藏如何保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無(wú)法正常進(jìn)行。要求：菌種不死，不污染，不變中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)（CCCCM)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC）等一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：如何保藏根據(jù)菌種特性和保藏目的不同，給特定環(huán)境使其存活而得以保存連續(xù)移種或改變環(huán)境條件：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)等斜面：可保存數(shù)周至數(shù)年，可用石蠟或橡皮塞封口，低溫延長(zhǎng)保存時(shí)間液體：菌苔制成菌懸液，低溫（懸液保藏法）缺點(diǎn)：繁瑣、易污染、變異喪生原有特性一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：傳代保藏斜面、半固體瓊脂柱、液體一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：冷凍保藏液氮保藏、低溫冰箱等液氮可達(dá)－196℃，效果較好注意：速凍，減少冰晶損傷細(xì)胞一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：干燥保藏沙土管保藏、冷凍真空干燥保藏沙土管：產(chǎn)孢子菌。制成孢子懸液，加無(wú)菌沙土管，減壓抽干水分，石蠟封口，冰箱保存。冷凍真空干燥：加保護(hù)劑樣品預(yù)先冷凍，真空冰升華去水，低溫保存，保存數(shù)十年，目前最普遍、最重要的方法，菌種保藏中心多采用此法。菌種保藏時(shí)采用不同手段保藏，防止某種方法失敗導(dǎo)致菌種喪失。二、顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果重要因素：分辨率和反差分辨率：辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力反差：樣品與背景區(qū)別程度普通顯微鏡機(jī)械裝置：鏡座、支架、載物臺(tái)、調(diào)焦螺旋光學(xué)系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器

普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖顯微鏡種類和原理：二、顯微鏡和顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？目鏡：10~15╳；物鏡：100╳；總放大倍數(shù)1000~1500╳；如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？使用油鏡，即在100╳物鏡和載玻片之間滴加香柏油；香柏油與玻璃折射率相近二、顯微鏡和顯微技術(shù)

0.5l分辨率（最小可分辨距離）=————nsinq分辨率與所用波長(zhǎng)成反比！二、顯微鏡和顯微技術(shù)分辨率與所用波長(zhǎng)成反比！N：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率空氣（