第14章 DNA的生物合成

1第14章DNA的生物合成2

分子生物學(xué)的中心法則(centraldogma)

DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄RNA復(fù)制3第一節(jié)DNA的復(fù)制replication一、DNA復(fù)制的基本特點(diǎn)1、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制（semiconservative

replication）

4親代DNA子代子代半保留復(fù)制新鏈1957,MathewMesselsonandFranklinStahlRadioisotopelabelinganddensitygradientcentrifugationclearlydistinguishesreplicationsofsemiconservativefromconservative.2、DNA復(fù)制具有固定的起點(diǎn)復(fù)制起始區(qū)：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開(kāi)始。(originofreplication,ori)復(fù)制子：獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的DNA單位真核生物染色體DNA復(fù)制有多個(gè)起始點(diǎn)——多復(fù)制子。細(xì)菌和真核生物細(xì)胞器DNA只有一個(gè)起始點(diǎn)——單復(fù)制子。復(fù)制叉：復(fù)制正在進(jìn)行的部位形成的叉狀結(jié)構(gòu)。7

原核生物雙向復(fù)制（θ型復(fù)制）3、DNA復(fù)制多為雙向復(fù)制，少數(shù)為單向8真核生物復(fù)制泡（復(fù)制起始點(diǎn)+復(fù)制叉）94、DNA復(fù)制方向始終是5’→3’5、DNA復(fù)制需要引物RNA或DNADNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離dNTP在DNA模板上聚合需要具3’-OH的引物引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去、補(bǔ)滿(mǎn)，再由連接酶連接RNA聚合酶能催化兩個(gè)游離NTP在DNA模板上聚合減少突變，提高DNA復(fù)制的真實(shí)性5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’

前導(dǎo)鏈隨從鏈崗崎片段6、DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous

replication）

體內(nèi)僅存在5’3’的DNA聚合酶

11前導(dǎo)鏈（leadingstrand）：

DNA復(fù)制時(shí)，一股以3’5’方向的母鏈作為模板，新合成的鏈以5’3’方向連續(xù)合成的鏈稱(chēng)為前導(dǎo)鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向一致）

12隨從鏈（laggingstrand):

DNA復(fù)制時(shí)，一股以5’3’方向的母鏈作為模板，新合成鏈沿5’3’合成1000-2000個(gè)核苷酸不連續(xù)的小片段稱(chēng)為隨從鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向相反)崗崎片段（Okazaki）崗崎片段由DNA連接酶連成一條完整的新鏈13

DNA半不連續(xù)復(fù)制：

3’5’方向母鏈為模板，新鏈5’3’方向連續(xù)合成5’3’方向母鏈為模板，新鏈5’3’方向合成許多不連續(xù)的片段（崗崎片段）這種復(fù)制方式稱(chēng)之為半不連續(xù)復(fù)制。14DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律聚合酶的校對(duì)機(jī)制RNA引物DNA損傷的修復(fù)機(jī)制7、DNA復(fù)制具有高度的忠實(shí)性15二、DNA復(fù)制所需的酶和蛋白質(zhì)dNTPMg++3’-OH引物DNA模板酶和蛋白質(zhì)因子DNA鏈合成的條件：16DNA聚合酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白(SSB）拓?fù)洚悩?gòu)酶引發(fā)酶DNA連接酶端粒酶酶和蛋白質(zhì)因子1718(1)細(xì)菌DNA聚合酶（原核生物）包括5種DNA聚合酶:polⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ1、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol）20

3’5’5’3’

外切酶聚合酶NC5’3’外切酶小片段35KD大片段（klenow片段）68KD切除RNA引物損傷修復(fù)校讀功能（常用的工具酶）1）DNA聚合酶Ⅰ（DNAPolymeraseⅠ）

Kornberg酶、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶

（DNA-DirectedDNAPolymerase,DDDP）聚合功能21DNApolⅠ作用切除RNA引物填補(bǔ)空缺損傷后修復(fù)2）DNA聚合酶Ⅲ全酶

（DNAPolymeraseⅢholoenzyme）10種亞基組成，含鋅θαετγ2δδ’χψβ(4個(gè))DNA聚合酶Ⅲ全酶核心聚合酶連接兩個(gè)核心聚合酶夾鉗裝置復(fù)合體星環(huán)狀,容納DNA雙鏈主要的復(fù)制酶Slidingclampsubunits聚合酶活性聚合酶活性3’5’外切活性γ復(fù)合物，促進(jìn)β亞基結(jié)合于DNADNApolIII

（復(fù)制酶）

無(wú)5`-3`外切酶活性αεθ組成核心酶促進(jìn)核心酶形成二聚體組裝γ2δδ’χψ243）DNA聚合酶Ⅱ、Ⅳ、ⅤDNA聚合酶Ⅱ5’3’聚合酶活性

3’5’外切酶活性

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ(1999年以后發(fā)現(xiàn)）

——DNA受?chē)?yán)重?fù)p傷時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生跨越受損部位使復(fù)制缺乏準(zhǔn)確性（修復(fù)酶）25（2）真核生物DNA聚合酶常見(jiàn)五種DNA聚合酶αDNA聚合酶δ和PCNADNA聚合酶γDNA聚合酶β、ε引物的合成前導(dǎo)鏈、隨從鏈合成參與線(xiàn)粒體DNA的合成參與DNA的修復(fù)增殖細(xì)胞核抗原（類(lèi)似于β亞基）262、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Linkingnumber兩條鏈的互繞數(shù)27283、DNA解鏈酶及SSBDNA解旋酶（helicase）單鏈結(jié)合蛋白

(SSB）

解開(kāi)DNA雙鏈

每對(duì)堿基消耗2個(gè)ATP維持單鏈狀態(tài)使其不受核酸酶水解避免單鏈DNA自身發(fā)夾螺旋形成使前端螺旋易解開(kāi)295、引發(fā)酶DNA聚合酶只能在模板鏈的指令下，在引物（通常RNA）3’-OH添加新核苷酸功能，沒(méi)有從頭合成活力；引物酶合成一小段RNA，作為DNA合成的引物；必須與幾種輔助蛋白組裝成引發(fā)體，才有合成引物的活性。如：DnaA、DnaB、DnaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等306、DNA連接酶催化二段DNA鏈之間3’,5’

磷酸二酯鍵的形成3’OH5’5’3’

OO-POO-有缺口的DNA鏈DNA連接酶ATPAMP+PPi

OO

POO-5’3’缺口封閉31哺乳動(dòng)物：ATP供能，大腸桿菌：NAD+供能，都需要Mg2+32缺口填補(bǔ):連接雙股DNA分子中一鏈的切口雙鏈DNA分子中雙鏈的切口不能連接二分子單鏈DNA33（1）崗崎片段之間的連接（2）DNA損傷修復(fù)中的連接（3）一種重要的工具酶:

限制性?xún)?nèi)切酶切割后形成的粘性末端 或平頭末端的連接應(yīng)用:3435三、DNA復(fù)制的過(guò)程(起始、延伸、終止）

確定復(fù)制的起始點(diǎn)解開(kāi)雙鏈DNA,提供單鏈DNA模板形成復(fù)制叉DNA合成的起始和延長(zhǎng)形成帶有新合成的DNA片段的復(fù)制泡復(fù)制的終止DNA雙鏈復(fù)制起始點(diǎn)

dnaAdnaB/dnaCDNA雙鏈解開(kāi)成單鏈DNASSB引物酶RNA引物/3’-OHDNA聚合酶ⅢdNTP和3’-OH形成3’，5’磷酸二酯鍵解旋酶SSBSSB3’3’5’5’引發(fā)體解旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶1、起始37（1）.DNA聚合酶Ⅲ的作用（2）.前導(dǎo)鏈合成1000-2000個(gè)核苷酸后，（3）.隨從鏈開(kāi)始合成，崗崎片段的長(zhǎng)度為1000-2000個(gè)（大腸桿菌）（4）.PolⅢ為不對(duì)稱(chēng)二聚體：一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈另一個(gè)作用于隨從鏈(loop)2、延伸383、終止去除RNA引物補(bǔ)充空缺連接DNA聚合酶Ⅰ的小片段

5’3’外切酶DNA聚合酶Ⅰ的大片段

3’5’外切酶

5’3’聚合酶DNA連接酶

393’5’5’3’四、真核生物DNA的復(fù)制真核生物的線(xiàn)性染色體DNA

每復(fù)制一次，子鏈5’有缺失末端有特殊序列---端粒特征:由數(shù)百個(gè)串聯(lián)重復(fù)的6核苷酸組成人:5’-AGGGTTAGGGTT-------3’端粒能穩(wěn)定染色體1.端粒(telomere)42二十世紀(jì)三十年代，遺傳學(xué)家BarbavaMcClintock和HermannJ.Muller發(fā)現(xiàn)，染色體的末端有一種能穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和功能的特殊成分。如缺少染色體間會(huì)互相粘連、出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化或其它錯(cuò)誤行為，以致影響染色體的生存和正確復(fù)制并進(jìn)一步威脅到細(xì)胞的存亡?！岸肆！保╰elomere）

希臘語(yǔ)末端“telos”和部分“meros”

端粒——

telomere

端粒帽染色體

端粒帽44線(xiàn)形DNA復(fù)制末端問(wèn)題3’5’5’3’RNA引物水解端粒染色體DNA端粒46

組成蛋白質(zhì)(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶人端粒酶:模板(RNA-端粒酶):3’-CAAUCCCAAUC-5’合成(DNA):5’---AGGGTT---3’端粒酶和衰老、腫瘤有關(guān)2.端粒酶（telomerase)TTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC3’5‘oH3’5’CCAACCCC3’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合

1.結(jié)合3.移位

爬行模式端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC末端補(bǔ)齊機(jī)制：5‘GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’3‘5’DNA聚合酶49端粒酶與細(xì)胞存亡端粒酶端粒

端粒酶催化端粒不斷延長(zhǎng)，從而抵消因染色體復(fù)制、細(xì)胞分裂導(dǎo)致的DNA縮短，使得染色體DNA完好無(wú)損，細(xì)胞能夠順利地分裂繁殖。

正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂

衰老死亡

細(xì)胞年輕化

端粒酶重新引入抗衰老5’5’端粒消耗端粒維持細(xì)胞衰老細(xì)胞永生化染色體DNA端粒端粒53七、DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制的調(diào)控發(fā)生在起始階段，一旦起始，復(fù)制必然進(jìn)行到終止。

細(xì)菌復(fù)制起始與DNA的甲基化有關(guān)Oric中含11個(gè)GATCDam甲基化酶使A上N6甲基化（親代）半甲基化的Oric可與細(xì)胞膜結(jié)合

真核生物復(fù)制起始受復(fù)制執(zhí)照因子的調(diào)控

第三節(jié)DNA的損傷、突變與修復(fù)56一、DNA的損傷571、堿基損傷堿基缺失或脫落堿基轉(zhuǎn)換堿基修飾堿基交聯(lián)堿基錯(cuò)配2、DNA鏈的損傷DNA鏈的斷裂DNA鏈的交聯(lián)DNA與蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)581、直接修復(fù)

需光復(fù)活酶嘧啶二聚體嘧啶單體

光復(fù)活酶（+）二、DNA損傷的修復(fù)59光復(fù)活/光修復(fù)①光復(fù)活酶識(shí)別TT→與之形成復(fù)合物②吸收光能③使TT解開(kāi)成為單體④酶從復(fù)合物中釋放僅作用于UV形成的產(chǎn)物601949年A.凱爾納偶然發(fā)現(xiàn)灰色鏈絲菌等微生物經(jīng)紫外線(xiàn)(UV)照射后如果立即暴露在可見(jiàn)光下則可減少死亡。此后在大量的微生物實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，并證明這是許多種微生物固有的DNA損傷修復(fù)功能,并把這一修復(fù)功能稱(chēng)為光復(fù)活。1958年R.L.希爾證明即使不經(jīng)可見(jiàn)光的照射，大腸桿菌也能修復(fù)它的由紫外線(xiàn)所造成的DNA損傷，而后又證明其他微生物也有這種功能,當(dāng)時(shí)就把這種修復(fù)功能稱(chēng)為暗復(fù)活或暗修復(fù)。此后發(fā)現(xiàn)暗修復(fù)普遍地存在于原核生物、低等真核生物、高等真核生物的兩棲類(lèi)乃至哺乳動(dòng)物中，并證實(shí)暗修復(fù)包括切除修復(fù)和復(fù)制后修復(fù)兩種。

61光復(fù)活酶已在細(xì)菌、酵母菌、原生動(dòng)物、藻類(lèi)、蛙、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳動(dòng)物中的有袋類(lèi)和高等哺乳類(lèi)及人類(lèi)的淋巴細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。這種修復(fù)功能雖然普遍存在，但主要是低等生物的一種修復(fù)方式，隨著生物的進(jìn)化，它所起的作用也隨之削弱。62（1）特異核酸內(nèi)切酶切除

DNA聚合酶Ⅰ填補(bǔ)、修復(fù)

DNA連接酶連接（2）人體重要的修復(fù)方式（3）缺乏UV特異核酸內(nèi)切酶

——著色性干皮病2、切除修復(fù)（excisionrepair）

631968年美國(guó)學(xué)者J.E.克利弗首先發(fā)現(xiàn)人類(lèi)中的常染色體隱性遺傳的光化癌變疾病──著色性干皮病(XP)是由基因突變?cè)斐傻腄NA損傷切除修復(fù)功能的缺陷引起的。這一發(fā)現(xiàn)為惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)理提供了一個(gè)重要的分子生物學(xué)證據(jù),也使DNA損傷修復(fù)的研究進(jìn)入了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。著色性干皮病患者的皮膚部位缺乏核酸內(nèi)切酶，不能修復(fù)被紫外線(xiàn)損傷的皮膚的DNA，因此在日光照射后皮膚容易被紫外線(xiàn)損傷，先是出現(xiàn)皮膚炎癥，繼而可發(fā)生皮膚癌。另外，患者還可能同時(shí)伴有眼睛和神經(jīng)的癥狀。著色性干皮病首先表現(xiàn)為對(duì)日光的高度敏感，這個(gè)癥狀在出生后不到一歲就可能出現(xiàn)，也就是說(shuō)患者經(jīng)輕度日曬后就會(huì)皮膚發(fā)紅，出現(xiàn)雀斑樣損害，甚至出現(xiàn)水皰，繼而出現(xiàn)皮膚萎縮、變薄、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素沉著和色素脫失、皮膚干燥、脫屑等，日久可引發(fā)皮膚的良性或惡性腫瘤，包括皮膚的基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、角化棘皮瘤、血管瘤和血管肉瘤等。腫瘤一般在10歲內(nèi)出現(xiàn)，大多數(shù)患者在20歲前就發(fā)展為腫瘤期。切除修復(fù)發(fā)生在復(fù)制之前核苷酸切除修復(fù)65堿基切除修復(fù)

DNA糖苷酶識(shí)別切除改變的堿基

核酸內(nèi)切酶切除磷酸二酯鍵

DNA聚合酶Ⅰ填補(bǔ)

DNA連接酶連接6667DNA堿基的組成為何是“T”

？（1）DNA中的C容易突變成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶識(shí)別DNA中的U（3）若DNA中存在U，無(wú)法區(qū)別突變U和正常UDNA中T的存在增加遺傳信息的穩(wěn)定性

RNA中的U：數(shù)量多/半衰期短/經(jīng)濟(jì)68——耗能的過(guò)程3、錯(cuò)配修復(fù)CH3GATC

CTAGGTGATC5′3′CTAG3′5′GTCH3CH3GATC

CTAGGTMutHMutSMutL切口CH3GATC

CTAGGT5′3′CH3

GATC5′3′

CTAG3′5′TGDNA解鏈酶核酸外切酶SSBdNMPsCH3GATC

CTAGGT5′3′DNA聚合酶

DNA連接酶dNTPsCH3GATC

CTAGGCDNA錯(cuò)配修復(fù)的模型4、重組修復(fù)（recombinationalrepair）復(fù)制后修復(fù)745、易錯(cuò)修復(fù)DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制——SOS反應(yīng)誘導(dǎo)修復(fù)系統(tǒng)：免錯(cuò)修復(fù)（errorfreerepair）易錯(cuò)修復(fù)（errorpronerepair）1、突變的類(lèi)型三、DNA突變762、自發(fā)突變和誘發(fā)突變

根據(jù)突變發(fā)生的原因可將突變分為:自然條件下未經(jīng)人工處理而發(fā)生的——自發(fā)突變（spontaneousmutation）經(jīng)人工處理而發(fā)生的突變——誘發(fā)突變（inducedmutaion）誘發(fā)突變的各種內(nèi)外因素統(tǒng)稱(chēng)為：

誘變劑（mutagen）

以RNA為模板，有逆轉(zhuǎn)錄酶的參與，在4種dNTP存在及適合的條件下，按堿基配對(duì)的原則，合成cDNA（complementaryDNA,cDNA）的過(guò)程。第四節(jié)DNA的逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

逆轉(zhuǎn)錄病毒最早于1911年由Rous從雞肉瘤組織中分離。

1970年Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，復(fù)制是通過(guò)DNA中間階段，病毒DNA可整合于宿主細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)關(guān)于DNA

RNA

蛋白質(zhì)的概念。因而獲NobelPrize.二、逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA病毒）的基因組逆轉(zhuǎn)錄病毒：雞肉瘤病毒（ASV）Rouse肉瘤病毒（RSV）小鼠白血病病毒（MuLV)人類(lèi)T細(xì)胞白血病病毒（HTLV-IⅡ）愛(ài)滋病病毒（HIV）SARS基因組：兩個(gè)完全相同的單鏈RNA

分子含有逆轉(zhuǎn)錄酶含來(lái)自宿主的tRNA

（合成時(shí)的引物）三、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase)

RNA依賴(lài)的DNA聚合酶（RDDP）產(chǎn)物：cDNA(cDNA中無(wú)內(nèi)含子）。催化三種反應(yīng)：RNA指導(dǎo)的DNA合成RNA水解DNA指導(dǎo)的DNA合成ASVRNARNA

DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)1.RNA指導(dǎo)DNA合成2.RNA水解3.DNA指導(dǎo)DNA合成逆轉(zhuǎn)錄酶的作用83五、逆轉(zhuǎn)錄的意義1、修正和補(bǔ)充了分子生物學(xué)的中心法則2、加深了對(duì)RNA病毒致瘤、致病的認(rèn)識(shí)3、逆轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)重要工具酶8420．下列關(guān)于大腸桿菌DNA連接酶的敘述哪些是正確的：A．催化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之?dāng)嚅_(kāi)的DNA鏈間形成磷酸二酯鍵B．催化兩條游離的單鏈DNA分子間形成磷酸二酯鍵C．產(chǎn)物中不含AMPD．需要ATP作能源8516．插入或缺失堿基對(duì)會(huì)引起移碼突變，下列哪種化合物最容易造成這種突變：A．口丫啶衍生物

B．5-