第二章下 酶的抑制動(dòng)力學(xué)

EnzymeEngineering

酶工程第二章酶催化的基礎(chǔ)知識(shí)

第三節(jié)酶的抑制動(dòng)力學(xué)及應(yīng)用去激活作用：

如EDTA去除二階金屬離子，以降低酶的活性。

此作用并非是化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶蛋白或其輔因子的直接作用。食品加工過(guò)程中由于多酚氧化酶的作用，發(fā)生酶促褐變，使果蔬類(lèi)加工食品貨架壽期縮短。多酚氧化酶是含銅金屬蛋白，因而許多金屬螯合劑是其抑制劑。研究酶抑制劑及其抑制作用的意義：

理論上：闡明酶活性中心、酶催化機(jī)理、代謝途徑、代謝調(diào)節(jié)、藥物和毒物作用機(jī)理。應(yīng)用上：（1）藥物：抑制病原微生物；治療代謝疾病；保健、美容等功效。（2）農(nóng)業(yè)中的殺蟲(chóng)劑和殺菌劑。（3）食品加工過(guò)程中有害酶的活性抑制劑。一、可逆抑制按抑制劑與酶的結(jié)合方式：

同位抑制作用：抑制劑與酶活性中心結(jié)合，阻斷酶分子的結(jié)合基團(tuán)或催化基團(tuán)，或者與ES復(fù)合物相結(jié)合，阻止底物形成產(chǎn)物。別位抑制作用：抑制劑與酶活性中心以外的部位結(jié)合，通過(guò)酶分子構(gòu)象的改變影響底物與酶的結(jié)合，進(jìn)而影響催化效率。（一）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的含義(1)竟?fàn)幮砸种颇承┮种苿┑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。米氏常數(shù)變大竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^(guò)增大底物濃度，即提高底物的競(jìng)爭(zhēng)能力來(lái)消除。競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)經(jīng)推導(dǎo)可得如下曲線(xiàn)1、Km增大即抑制劑與酶結(jié)合后，酶和底物親和力降低；

I

越高、Ki越小，Km增大。酶和底物親和力降低，酶反應(yīng)速度減慢。2、Vm不變3、增大底物濃度，有利于酶和底物結(jié)合，可減輕抑制作用；反之，增加抑制劑濃度，加深抑制程度。2.競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的機(jī)理（1）抑制劑與底物在結(jié)構(gòu)上有類(lèi)似之處（2）可能結(jié)合在底物所結(jié)合的位點(diǎn)（如結(jié)合基團(tuán)）上，從而阻斷了底物和酶的結(jié)合（3）降低酶和底物的親和力。3.競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用舉例丙二酸是琥珀酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，可逆抑制琥珀酸脫氫酶活性乙醇作為競(jìng)爭(zhēng)性底物可以抑制乙二醇氧化成乙醛的反應(yīng)，（因此乙醇可以用于治療乙二醇中毒）抑菌劑二氫葉酸合成酶轉(zhuǎn)肽基酶兩者結(jié)構(gòu)類(lèi)似，故可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制轉(zhuǎn)肽酶，導(dǎo)致胞壁合成障礙。

酶抑制劑：是一類(lèi)可以結(jié)合酶并降低其活性的分子。由于抑制特定酶的活性可以殺死病原體或校正新陳代謝的不平衡，許多相關(guān)藥物就是酶抑制劑。一些酶抑制劑還被用作除草劑或農(nóng)藥

20世紀(jì)60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念,從而將抗生素的研究擴(kuò)大到酶抑制劑的新領(lǐng)域。酶抑制劑新藥發(fā)現(xiàn)的途徑：一是來(lái)源于天然化合物，包括動(dòng)植物和各種微生物等，二是化學(xué)合成物。在目前上市的藥物中，以受體為作用靶點(diǎn)的藥物占52%，以酶為靶點(diǎn)的藥物占22%，以離子通道為靶點(diǎn)的藥物占6%，以核酸為靶點(diǎn)的藥物占3%。因此，酶抑制劑的開(kāi)發(fā)是新藥來(lái)源的一個(gè)主要途徑。以酶為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新藥存在巨大潛力，今后很長(zhǎng)一段時(shí)間仍然是發(fā)現(xiàn)新藥的重要著手點(diǎn)。4．過(guò)渡態(tài)的類(lèi)似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑

所謂過(guò)渡態(tài)底物是指底物和酶結(jié)合成中間復(fù)合體后被活化的過(guò)渡形式，一般用S*表示，由于其能障小，和酶結(jié)合就緊密得多。4過(guò)渡態(tài)的類(lèi)似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑（二）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（uncompetitiveinhibition）

對(duì)酶活性的一種抑制作用，由于所加入的抑制劑能與酶-底物復(fù)合物結(jié)合，而不與游離酶結(jié)合，所以其特征是反應(yīng)的最大速度比未加抑制劑時(shí)反應(yīng)的最大速度低，當(dāng)以速度的倒數(shù)相對(duì)底物濃度的倒數(shù)作圖，所得圖線(xiàn)與未被抑制反應(yīng)的圖線(xiàn)平行。反競(jìng)爭(zhēng)抑制作用

加入I時(shí)，反而可增加S對(duì)E的親和力，而增加S并不能減輕或消除抑制；有I時(shí)，Km減小，說(shuō)明I可使E對(duì)S的親和力增大。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)2.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制舉例單底物酶：芳香基硫酸基的肼解氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用多底物：如雙底物乒乓機(jī)制中，任何一個(gè)底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑也是另一底物的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。（三）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（noncompetitiveinhibition）

抑制劑在酶的活性部位以外的部位與酶結(jié)合，不對(duì)底物與酶的活性產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。

作用：抑制劑不僅與游離酶結(jié)合，也可以與酶-底物復(fù)合物結(jié)合的一種酶促反應(yīng)抑制作用。酶-底物-抑制劑復(fù)合物（ESI）不能進(jìn)一步釋放出產(chǎn)物。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類(lèi)物質(zhì)并不是與底物競(jìng)爭(zhēng)與活性中心的結(jié)合，所以稱(chēng)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。特點(diǎn)：⑴非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似；⑵底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改變對(duì)抑制程度無(wú)影響；⑷動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)可推導(dǎo)得出如下的曲線(xiàn)1、Vm降低即

I

越大、Ki越小，形成不能轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的EI和EIS越多，V降低的程度越顯著。2、Km不變3、增大底物濃度，不能減輕抑制作用，無(wú)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系；2.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制舉例（四）混合型抑制作用

是非競(jìng)爭(zhēng)性與其他兩種類(lèi)型的混合，競(jìng)爭(zhēng)性與反競(jìng)爭(zhēng)性抑制二者之間不存在混合型。（五）其他可逆抑制1．底物抑制2．產(chǎn)物抑制2．產(chǎn)物抑制產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用在生物體中較為常見(jiàn)，在細(xì)胞內(nèi)，酶反應(yīng)的產(chǎn)物雖然不斷被另外的酶作用，但S和P總是同時(shí)存在的，因此，考慮產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)速度的影響，可能具有一定的意義。二、不可逆抑制作用不可逆抑制作用：如果[E]>[I],則I只能使部分的酶失活，余下的酶仍是正常的，可以行使正常的催化功能。米氏常數(shù)不變，而Vmax下降，得到的雙倒數(shù)圖和可逆抑制中的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制非常相似。

非專(zhuān)一性：專(zhuān)一性（一）非專(zhuān)一性的不可逆抑制作用1．概念：抑制劑能和酶上的一類(lèi)或幾類(lèi)基團(tuán)反應(yīng)。2類(lèi)型：重金屬、?；瘎?、烴基化劑、含活潑雙鍵的試劑、有機(jī)磷化合物、烷化劑、還原劑農(nóng)藥殺蟲(chóng)的機(jī)理-抑制生物體中的靶酶。

乙酰膽堿酯酶（ACHE）：催化乙酰膽堿，水解為膽堿和乙酸例如：有機(jī)磷的殺蟲(chóng)原理主要是：有機(jī)磷對(duì)生物體神經(jīng)突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶（ACHE）的抑制，造成突觸間隙乙酰膽堿的積蓄，持續(xù)地作用于受體，引起一系列反應(yīng)使病蟲(chóng)神經(jīng)過(guò)度興奮而死亡（二）專(zhuān)一性不可逆抑制劑概念：抑制劑通常只作用于酶蛋白分子中一種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)或僅作用于一類(lèi)酶。專(zhuān)一性不可逆抑制劑的類(lèi)型:1．Ks型結(jié)合型不可逆抑制劑2．Kcat型催化型不可逆抑制劑（自殺底物）1、Ks型結(jié)合型專(zhuān)一性不可逆抑制劑抑制劑只能專(zhuān)一地與某種酶結(jié)合而引起的不可逆抑制作用根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以和酶結(jié)合，并對(duì)酶的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而抑制酶的活性。是利用對(duì)酶的親和力而對(duì)酶進(jìn)行修飾標(biāo)記，所以又稱(chēng)親和標(biāo)記試劑。舉例：1對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶2對(duì)甲苯磺酰-L-賴(lài)氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶2．Kcat型催化型不可逆抑制劑（自殺底物）

抑制劑能專(zhuān)一地與某種酶結(jié)合并發(fā)生催化反應(yīng)，而反應(yīng)的產(chǎn)物中含有一個(gè)基團(tuán)可以與酶分子活性中心的基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致酶分子不可逆地喪失催化活性。Kcat型不可逆抑制劑（自殺底物）（1）天然酶的自殺底物（2）治療用人工合成的酶自殺底物（2）治療用人工合成的酶自殺底物治療高血壓；癲癇；抗青霉素的菌株；在腫瘤治療上；治療震顛麻痹癥；痛風(fēng)癥的自殺底物療法。例：以FMN或FAD為輔酶的單胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制劑迫降靈酶抑制劑的抑制程度：

在抑制劑存在下，酶反應(yīng)速度下降的成都，常用有抑制作用的反應(yīng)速度（vi）與無(wú)抑制作用的反應(yīng)速度（v）。a：相對(duì)活力分?jǐn)?shù)i：抑制分?jǐn)?shù)i＝1－a第四節(jié)酶的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)酶濃度的調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)的實(shí)例：

凝血酶、胰蛋白酶激活

糖元磷酸化酶活性轉(zhuǎn)化

母體分娩后母乳中乳糖合成

丙二酸抑制琥珀酸脫氫酶活性

蘇氨酸到異亮氨酸的代謝途徑控制

說(shuō)明了——正常情況下生物體并不要求每個(gè)酶處于最有效的催化狀態(tài)，而是要求有快有慢。在長(zhǎng)期的進(jìn)化、選擇過(guò)程中，生物體為適應(yīng)外界環(huán)境變化，滿(mǎn)足生理功能的需要，形成了一整套調(diào)節(jié)機(jī)制。（酶合成水平上的調(diào)節(jié)和酶結(jié)構(gòu)活性水平上的調(diào)節(jié))

多種調(diào)節(jié)方式：

濃度調(diào)節(jié)（合成降解調(diào)節(jié))；

生理調(diào)節(jié)(激素調(diào)節(jié))；

共價(jià)修飾調(diào)節(jié)（可逆，不可逆)；抑制劑調(diào)節(jié)；

反饋調(diào)節(jié)（別構(gòu)調(diào)節(jié)）；

存在方式調(diào)節(jié)（多酶體系）；

寡聚酶的聚合、解聚調(diào)節(jié)；

1.調(diào)節(jié)酶在細(xì)胞內(nèi)的濃度

如：大腸桿菌的葡萄糖效應(yīng)，即在有葡萄糖存在時(shí)，它不利用乳糖。原理可以用乳糖操縱子模型來(lái)解釋。腺苷酸環(huán)化酶

AMPcAMP+H2O

磷酸二脂酶乳糖操縱子模型

2.生理調(diào)節(jié)或激素調(diào)節(jié)在特殊生理?xiàng)l件下，分泌某一種激素來(lái)調(diào)節(jié)酶的活性。如：乳腺組織中的乳糖合成酶。

乳糖合成酶是蛋白A和蛋白B兩組分構(gòu)成的復(fù)合物，可以催化乳糖合成反應(yīng)：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP

蛋白A不能催化上述反應(yīng)而能催化下述合成反應(yīng)：UDP-半乳糖+N-乙酰葡糖胺N-乙酰半乳糖胺+UDP

蛋白B本身無(wú)催化能力，但其與蛋白A結(jié)合，可以改變蛋白A的底物專(zhuān)一性。A

3、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)

不可逆共價(jià)調(diào)節(jié)——酶原激活

◆一些酶（主要是消化酶和執(zhí)行防御功能的酶）在細(xì)胞內(nèi)以無(wú)活性前體形式（即酶原）合成和分泌，然后輸送到胞內(nèi)外作用部位去，當(dāng)功能需要時(shí)就會(huì)被活化而起作用。可以想象，必須有一種調(diào)控機(jī)制，使其在胞內(nèi)合成時(shí)處于失活狀態(tài)，而在需要時(shí)激活；◆在酶原激活過(guò)程中，酶原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了這樣的變化：

首先，酶原分子被切去若干小段，即發(fā)生一級(jí)結(jié)構(gòu)變化、

一級(jí)結(jié)構(gòu)變化引起酶分子活性部位構(gòu)象變化，形成能與特異性底物相結(jié)合的完整的疏水口袋。胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶Ser14—Arg15Thr147—Asn148A鏈B鏈C鏈胰凝乳蛋白酶原（無(wú)活性）π--胰凝乳蛋白酶（有活性）α--胰凝乳蛋白酶（有活性,穩(wěn)定）α--胰凝乳蛋白酶（三鏈間有二硫鍵）◆α--胰凝乳蛋白酶為穩(wěn)定的形式，A、B兩鏈及B、C兩鏈間各通過(guò)一對(duì)大的二硫鍵相連，其活性只有π--胰凝乳蛋白酶的2/5◆酶活性中心的氨基酸殘基來(lái)自B、C二鏈

胰凝乳蛋白酶原受胰蛋白酶作用后，Arg15-Ile16間的肽鍵被打斷，形成了新的Ile16末端，這個(gè)新末端的氨基再與酶分子內(nèi)部的Asp194發(fā)生靜電作用,

觸發(fā)一系列的構(gòu)象變化：Met192從酶分子的深層移動(dòng)到酶分子的表面，第187及第193殘基更加舒展等，這些改變的總結(jié)果是造成一個(gè)口袋——允許帶芳香族的底物或帶一個(gè)較大的非極性脂肪族鏈的底物進(jìn)入專(zhuān)一性部位消化系統(tǒng)其它蛋白水解酶原的激活胃蛋白酶原（pepsinogen）由胃壁細(xì)胞分泌出來(lái)，在胃酸H+作用下，低于pH5時(shí)，酶原自動(dòng)激活，失去44個(gè)氨基酸殘基，轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨人嵝缘?，有活性的胃蛋白酶胰蛋白酶原（trypsinogen）進(jìn)入小腸后，在有Ca2+的環(huán)境中受到腸激酶的激活，賴(lài)氨酸-異亮氨酸之間的肽鍵被打斷，水解失去一個(gè)6肽，使構(gòu)象發(fā)生一定變化后，成為有活性的胰蛋白酶羧肽酶原A彈性蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶羧肽酶原羧肽酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶對(duì)各個(gè)胰臟蛋白酶原的激活作用

綜上所述，酶原激活有兩個(gè)特點(diǎn)：是蛋白質(zhì)肽鏈的水解過(guò)程，不可逆激活后，不能變?yōu)槊冈瓲顟B(tài)，因而這是“一次性”的調(diào)節(jié)，能及時(shí)地從靶部位通過(guò)自身催化或組織蛋白酶的作用而降解移去都是通過(guò)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的快速的信號(hào)放大過(guò)程，以完成特定功能

可逆的共價(jià)調(diào)節(jié)

由于其他的酶對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行共價(jià)修飾，而使其在活性形式與非活性形式之間進(jìn)行互變.第一種類(lèi)型是磷酸化酶及其他的一些酶，它們通過(guò)接受ATP轉(zhuǎn)來(lái)的磷酸基的共價(jià)修飾，或脫下磷酸基，來(lái)調(diào)節(jié)酶活性：酶的無(wú)活性形式酶的有活性形式最典型的例子是動(dòng)物組織中的糖原磷酸化酶：（葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸-葡萄糖E糖原磷酸化酶的活性形式及非活性形式間的平衡，是磷酸基共價(jià)地結(jié)合到酶上或從酶上脫下，從而控制調(diào)節(jié)磷酸化酶的活性糖原磷酸化酶及其他受共價(jià)修飾調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)酶可以將化學(xué)信號(hào)極大的放大。如一分子磷酸化酶的激酶可以催化幾千個(gè)無(wú)活性的磷酸化酶b分子變?yōu)橛谢钚缘牧姿峄竌，從而催化糖原形成幾千個(gè)分子的1-磷酸葡萄糖，這就形成了具有兩步的級(jí)聯(lián)放大（amplificationcascade）實(shí)際上這兩個(gè)酶是腎上腺素激素分子化學(xué)信號(hào)造成組織中糖原急劇分解的一個(gè)更長(zhǎng)的級(jí)聯(lián)放大中的一部分.見(jiàn)圖+4H2O4ADP4Pi4ATPPPPP磷酸化酶激酶磷酸化酶磷酸酶磷酸化酶a（有活性）磷酸化酶b（無(wú)活性）第二種類(lèi)型是大腸桿菌谷氨酰胺合成酶及其他一些酶，它們受ATP轉(zhuǎn)來(lái)的酰苷?；墓矁r(jià)修飾，或酶促脫酰苷?；?，而調(diào)節(jié)酶活性：酶的活性較高形式酶的活性較低形式谷氨酰胺合成酶催化下列反應(yīng)：ATP+谷氨酸+NH3ADP+谷氨酰胺+Pi

它有12個(gè)亞基，酰苷?；鶑腁TP脫下后