第五章.分子生物學(xué)的研究方法-電泳、雜交

第五章分子生物學(xué)研究的主要方法序：重組DNA技術(shù)回顧第一節(jié)DNA基本操作技術(shù)第二節(jié)RNA基本操作技術(shù)—RNA提取第三節(jié)DNA與蛋白質(zhì)互作第四節(jié)基因組技術(shù)第五節(jié)蛋白質(zhì)組技術(shù)第六節(jié)基因克隆技術(shù)DNA提取分離核酸的凝膠電泳PCR基因擴(kuò)增基因定點(diǎn)誘變核酸序列分析核酸分子雜交DNA分子切割與連接1序：重組DNA技術(shù)回顧重組DNA技術(shù)的誕生

（一）重組DNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)

1.40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

232、50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制43、50年代末和60年代:“中心法則”、操縱子學(xué)說、破譯遺傳密碼5（二）關(guān)鍵性實驗技術(shù)問世為重組DNA技術(shù)奠定基礎(chǔ)DNA分子的切割與連接技術(shù)DNA序列分析載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立Southern雜交、和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸凝膠電泳。。。。6重組DNA技術(shù)的定義及步驟（一）重組DNA技術(shù)

1、重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology):

按照人的意愿，在體外對DNA分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中穩(wěn)定地增殖、表達(dá)，以大量獲得相關(guān)基因的產(chǎn)物或新品種新產(chǎn)物。7指由一個細(xì)胞通過無性繁殖以后形成的與親代完全相同的子代群體。分子克隆（molecularcloning）：構(gòu)建DNA重組體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞建立無性繁殖體系。2.克?。╟lone):8重組DNA技術(shù)的一般步驟目的基因獲得功能研究轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞9第一節(jié)DNA基本操作技術(shù)——一、DNA提取分離1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等，抑制脫氧核糖核酸酶；（2）有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。

SDS：（1）溶解膜脂質(zhì)與蛋白。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。

提取液離心組織上清液沉淀TE溶液無水乙醇離心RNase103.溶液III：3mol／LNaAc（pH4.8）溶液(質(zhì)粒DNA）調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽有利于染色體DNA、RNA（中和核酸上的電荷）以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀（鈉鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物）。

4．無水乙醇沉淀DNA：一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇。

5．NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L：中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力。

116．RNase、SDS與KAc/飽和酚、氯仿：SDS可使RNase成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

7．T-E緩沖液:DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等都可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀.8.Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng):不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)12二、核酸的凝膠電泳

1.基本原理

2.瓊脂糖凝膠電泳

3.脈沖電場凝膠電泳131原理電泳及遷移率核苷酸鏈為多聚帶電陰離子無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)電泳遷移率+142瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖為線性多糖聚合物，紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固，密度由濃度決定的。分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān):瓊脂糖凝膠分辨范圍為0．2～50kb之間.15不同濃度瓊脂糖凝膠的分辨能力凝膠類型及濃度

分離DNA片段的大小范圍（bp）

0.3％瓊脂糖50000～10000.7％瓊脂糖20000～10001.4％瓊脂糖6000～3004.0％瓊脂糖1000～10010％瓊脂糖500～2520％瓊脂糖50～116電泳槽結(jié)構(gòu)17電泳裝置18常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.

指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。19溴化乙錠（EB）—DNA：紫外光下紅色熒光二甲苯青:水溶液呈蘭色，在1%和1.4%瓊脂糖中遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA相似.指示劑一般與蔗糖、甘油組成載樣緩沖液.①增加樣品密度.②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置.③使樣品呈色，加樣操作更方便20溴化乙錠染色溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr）在一切可能的部位同DNA分子結(jié)合，卻不能同瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠結(jié)合,并在300nm紫外光照射下放射出橘紅色的光，可顯現(xiàn)凝膠中0.05ug的微量DNA

方法：加入凝膠中，凝膠浸泡重要的特性：熒光強(qiáng)度同DNA片段的大小或數(shù)量成正比。2122銀染銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收23LMP瓊脂糖回收DNA分子LMP瓊脂糖：一種熔點(diǎn)為62～65℃的瓊脂衍生物，熔解后，在37℃可保持液體狀態(tài)數(shù)小時，在25℃可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10分鐘?；厥誅NA：將凝膠65℃加熱，加入過量的酚，離心，上清液中便含有除去了瓊脂糖的DNA。另外，一旦LMP瓊脂糖已經(jīng)熔化，并保持在37℃下，就可直接進(jìn)行酶催反應(yīng)。據(jù)此，可以對電泳分離的DNA酶切片段進(jìn)行第二種酶切反應(yīng)。2425變性膠電泳方法用途26273脈沖電場凝膠電泳DNA大分子的分離：瓊脂糖凝膠不能分離大于750kb的DNA。常規(guī)凝膠，超過一定大小范圍的所有的雙鏈DNA分子，都按相同速率遷移。。1984，Schwartz和Cantor：脈沖電場凝膠電泳（pulsed－fieldgelelectrophoresis，簡稱PFGE）技術(shù)，可分離整條染色體。大分子量DNA需更多次數(shù)更換構(gòu)型和方位，以便按新方向游動。遷移速率慢，可分離到107bpDNA大分子。28“電泳”思考題電泳的原理是什么請說出以下電泳用膠的區(qū)別：普通DNA分離、測序膠、Southern雜交比較分子量相同的三種不同構(gòu)型的DNA（直鏈線形、閉合環(huán)形、開鏈環(huán)形）在同一電場中的電泳遷移率比較溴化乙錠染色和銀染的區(qū)別說明電泳技術(shù)在基因工程中的作用返回第二章29三、核酸分子雜交

1.SouthernDNA印跡雜交

2.NorthernRNA印跡雜交

3.Western印跡雜交

4.菌落(或噬菌斑)雜交

5.斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交返回第二章301Southernblot根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA