細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

植物原生質(zhì)體的分離、純化及融合引言原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，分離的原生質(zhì)體能合成新壁，進(jìn)行細(xì)胞分裂，并再生成完整植株。分離原生質(zhì)體采用酶解法。其原理是根據(jù)由纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶配制而成的溶液對細(xì)胞壁成分的降解作用，而使原生質(zhì)體釋放出來。原生質(zhì)體的產(chǎn)率和活力與材料來源、生理狀態(tài)、酶液的組分，以及原生質(zhì)體收集方法有關(guān)。酶液通常需要保持較高的滲透壓，以使原生質(zhì)體在分離前細(xì)胞處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，分離之后不致膨脹破裂。滲透劑常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中還應(yīng)含一定量的鈣離子，來穩(wěn)定原生質(zhì)膜。游離出來的原生質(zhì)體可用過篩一低速離心法收集，用蔗糖漂浮法純既，然后進(jìn)行培養(yǎng)。不同種植物的原生質(zhì)體可在人工誘導(dǎo)條件下融合，所產(chǎn)生的雜種細(xì)胞，即異核體經(jīng)過培養(yǎng)可再生新壁，分裂形成愈傷組織，進(jìn)而分化產(chǎn)生雜種植株。由于進(jìn)行融合的原生質(zhì)體來自體細(xì)胞，故該項(xiàng)技術(shù)也叫體細(xì)胞雜交。原生質(zhì)體融合能使有性雜交不親合的植物種間進(jìn)行廣泛的遺傳重組，因而在農(nóng)業(yè)育種上具有巨大的潛力。在植物遺傳操作研究中也是關(guān)鍵技術(shù)之一。

人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合可使用物理學(xué)方法，如運(yùn)用細(xì)胞融合儀，在電場誘因?qū)聦?shí)現(xiàn)融合，然而至今廣為使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后用高pH鈣溶液相處理的化學(xué)方法（Kao等，1974）。該法應(yīng)用分子量至為1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后用高pH的鈣溶液稀釋時，就產(chǎn)生了高頻率的融合，融合的頻率和省略常與所有PEG的分子量、濃度，作用時間，原生質(zhì)體的生理狀態(tài)與密度以及操作者的細(xì)心程度有關(guān)。1材料、試劑與方法1.1材料菠菜葉片,唐古特白刺愈傷組織,金盞菊花瓣。1.2試劑1.70％酒精。2.0.1％升汞水溶液，并滴入少許TWeen80。3.滅菌蒸餾水。4.0.16mo／L和0.20mo／LCaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-嗎啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。5.20％和12％蔗糖溶液，pHPH5.8~6.2。6.酶液A纖維素酶(cellulase，OnozukaR-102％果膠酶(13ectinase，Serva)1%(若用國產(chǎn)EA3-867纖維索酶，則果膠酶可省去。)甘露醇0.6mol／LCaCl2·2H2O0.05mol／LMES0.1％pH5．8～6．27．酶液B纖維素酶(OnozukaR-10)2％離析酶(MacerozymeR-10)1％半纖維素酶(hemicellulase，Sigma)0.2％甘露醇0.4mol／LCaCl2·2H200.1％MES PH5.8～6.28．PEG溶液9.高pH，高鈣稀釋液1.3方法1.3.11.取充分展開的葉片和花瓣，用自來水沖洗干凈。(以下步驟均在超凈臺上進(jìn)行)。2.將葉片在0·1％升汞溶液中浸泡滅菌10min，中間搖動幾次。取出后用無菌蒸餾水漂洗5次3.將葉片移入大培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸去上面的水珠。然后將葉背面朝上，小心用鑷子撕去下表皮。1.3.24.將撕去下表皮后的葉片放進(jìn)預(yù)先放有酶液A的培養(yǎng)皿或帶蓋蘭角瓶中，每10ml酶液約放2g葉片。若葉片不易撕下下表皮，可用鋒利的解剖刀將葉片切成約0.5mm寬的小條，放入酶液。5.將培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)Х饪?，?8℃條件下保溫3～6h，中間輕輕搖動2～3。在倒置顯微鏡下檢查，直到產(chǎn)生足夠量的原生質(zhì)體。1.3.6.將酶解后的原生質(zhì)體懸浮液用不銹鋼網(wǎng)篩過濾到小燒杯中，以除去未酶解完全的組織。7.將濾液分裝在刻度離心管中，用600r／min的速度離心5min，使原生質(zhì)體沉淀下來。8.用移液管吸去上清液。將沉淀的原生質(zhì)體懸浮在2ml0.2mol／L的CaCl2·2H2O中。9.用注射糙伸長針頭向離心管生部緩緩注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min下離心5min。此步完成后，在兩相溶液的界面之間將出現(xiàn)一層純凈的完整原生質(zhì)體帶，雜質(zhì)，碎片將沉到管底。10.注射器吸出管底雜質(zhì)和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。11.離心管中留下的純凈原生質(zhì)體用8ml0.2mol／L的CaCl2·2H2O懸浮。離心離心5min，吸去上清液。再用培養(yǎng)基如法洗滌一次。1.3.12．將收集的兩種不同材料的原生質(zhì)體分別懸浮在0.16mol/L的CaCl2·2H2O13．將兩種原生質(zhì)體懸液等量混合。14．用刻度吸管將混合的原生質(zhì)體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴約0.1ml。然后靜置10in，使原生質(zhì)體貼壁。15．用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質(zhì)體液滴上，再靜置10~15min。此時可取一個平皿在顯微鏡上觀察原生質(zhì)體間的粘連。16．用刻度吸管向原生質(zhì)體液滴慢慢地加入高pH、高鈣稀液。第一次加0.5ml，第2次1ml，第3、4次各2ml，每次之間間隔5min。17.將平皿稍微傾斜，吸去上清液，再緩緩加入4ml稀釋液。5min后，再傾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液時勿使原生質(zhì)體漂浮起來。18.用PEG培養(yǎng)基如上法換洗二次。19.每平皿中加培養(yǎng)基2ml，輕輕搖動平皿。1.3.520.用蠟?zāi)っ芊馄矫?。?60下進(jìn)行24h暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)到弱光條件下培養(yǎng)2結(jié)果與分析2.1結(jié)果展示圖(一)原生質(zhì)條帶圖(二)原生質(zhì)體融合2.2結(jié)果分析用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑的情況下，兩個植物細(xì)胞能夠融合，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞。3討論兩細(xì)胞融合現(xiàn)通常分為五個階段。①兩細(xì)胞膜接觸，粘連；②細(xì)胞膜形成穿孔；③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；④通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體；⑤細(xì)胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞。參考文獻(xiàn)[1]郭曉華,那寧馨.新疆楊組織培養(yǎng)