dna重組技術的研究進展

dna重組技術的研究進展

現代生物學研究需要對dna技術的重組。細胞內發(fā)生的DNA重組現象,稱為體內(invivo)重組。由于新技術的發(fā)展,現在可以由人工操作在細胞外進行DNA重組,稱為體外(invitro)重組。人工重組的DNA分子可以送回到活細胞里面去。經典遺傳學揭示出細胞的染色體上存在著基因(gene),即DNA分子上一段特定的核苷酸序列,具有重組、突變、轉錄和對其他DNA片段有調控作用的遺傳學功能,它是不同物種以及同一物種的不同個體表現出不同性狀的根本原因?；蛲ㄟ^DNA復制及細胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代,并通過控制蛋白質的合成使遺傳信息得以表達。如果重組的DNA是具有功能的基因,就可以通過表達而使受體表現新性狀。所謂基因工程(geneengineering)或生物技術(biotechnology)就是運用重組DNA技術改變物種的基因,進而改造出人們所期望的生物性狀,并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。重組DNA技術在細胞分化、生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生等基礎研究和工農業(yè)生產、醫(yī)藥保健等實際應用兩方面均有重要意義。通過DNA的重組獲得基因的克隆是研究基因的結構、功能及演化的基礎?；蚩寺〖夹g,又被稱為分子克隆技術、重組DNA技術、基因工程、基因操作或基因的無性繁殖等。在整個基因克隆的過程中,DNA的重新組合是一個十分關鍵的步驟,它直接決定著整個克隆的成功與否。隨著時間的推移,研究的深入,越來越多的DNA重組方法被應用到生產和科研當中。為了進一步闡明及比較各種DNA重組方法的異同和優(yōu)劣,本文就目前已報道的DNA重組技術進行了概述,重點闡述了各自的原理、步驟、特點及實際應用等方面。1重組子和克隆經典克隆方法產生于20世紀70年代初,是最早應用的基因克隆方法,它要求首先需從細胞或組織中分離并獲得含有目的基因的DNA片段,然后利用能識別特異DNA序列的限制性內切核酸酶(restrictionendonuclease)切斷DNA雙鏈,產生兩個單鏈黏性末端(stickyend)或平齊末端(bluntend),如果被插入的載體DNA具有相同的末端,那么在適宜的條件下,具有黏性末端的兩種片段可經堿基間的氫鍵互補配對,形成雙鏈DNA分子,再在DNA連接酶的作用下形成磷酸二脂鍵,連接成重組DNA分子,而具有平齊末端的兩種片段也可經DNA連接酶的作用而組成重組DNA分子,然后在利用重組子轉化技術使該分子在宿主細胞中復制,產生多個完全相同的拷貝,即克隆(clone)。這種傳統的酶切-連接經典克隆法,是比較通用且常規(guī)的方法,一直沿用至今。該方法也在獲取基因片段和開發(fā)新的載體上不斷改進,如PCR技術的建立、基于測序和DNA合成技術使該法的適用性越來越廣,已成為最為基礎的分子生物學實驗手段之一。目前,研究人員已通過該方法獲得了大量包括植物、真菌、哺乳動物、線蟲等生物中重要基因和元件的克隆,如:錢麗等克隆得到了人腫瘤相關的β2m基因,并在大腸桿菌中實現了高效表達;張憲銀等克隆了水稻Gt1基因的啟動子,并進一步證實該元件具有胚乳特異性表達的功能。然而在實際的實驗過程中,這種方法的步驟顯得較為繁瑣,比較費時,有時對于某些片段失敗率較高,且缺乏DNA序列的一致性;而且在應用上也有一定的限制,比如從擁有較大且富含重復序列的基因組中克隆某個基因,用這種方法就不太容易找到引物的設計位點和可利用的酶切位點。因此,分子生物學研究迫切需要新的DNA重組技術來快速并系統地進行可利用基因的操作。2基于重組的隆慶方法2.1獨特的異質重組技術2.1.1認識到cre-lox的位點抑制劑Liu等于1998年首次報道了一種基于重組的基因克隆方法——UPS,開啟了利用DNA序列間直接重組克隆基因的時代。該系統是催化含有目的基因片段的特殊載體——通用載體(pUNI)與含有相關調控信息的宿主載體(pHOST)之間質粒融合。融合質粒經過選擇后,使目的基因受控于位于宿主載體上的新的啟動子等調控元件,從而完成目的基因-表達載體的構建。該克隆過程無需限制性內切核酸酶、DNA連接酶以及許多針對于亞克隆的體外操作,因而使得重組DNA分子的構建過程更為快速和簡便。該系統是建立在噬菌體Pl的Cre-loxP位點特異性重組之上的質粒融合系統。Cre基因的轉錄翻譯產物是一種位點特異性重組酶,能夠催化兩個34bp大小的loxP位點序列(5′-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3′)之間的重組,從而使環(huán)狀溶原性復制產物Pl二聚體分解。Cre不僅能在不同生物體如細菌、真菌及哺乳動物的細胞中行使功能,而且在體外也可催化重組反應,因此,這種由Cre-loxP介導的質粒融合在體內外均可發(fā)生。另外,UPS還能夠被用于整個DNA文庫與新表達載體的融合,從而產生出多個新的文庫。該系統已廣泛應用于各種生物中的基因研究,如王弘等構建了一種以GFP為報告基因的釀酒酵母表達載體,并同時驗證了其穩(wěn)定性、高效性和準確性。2.1.2gatew技術的特點Gateway系統是Invitrogen公司于1999年推出的一種新的克隆策略,是由噬菌體λ整合酶催化的位點特異性重組反應,由BP和LR兩個反應組成,可表示為attB×attP←→attL×attR。介導重組反應的4個att位點序列和相關蛋白是Gateway克隆技術的基礎,它們能被λ和大腸桿菌編碼的克隆酶合劑特異識別,雙載體發(fā)生融合后,產生出新的質粒表達載體。BP反應是利用由λ基因組編碼的整合酶(integrase,Int)和由大腸桿菌編碼的整合宿主因子(integrationhostfactor,IHF)組成的BP克隆酶混和物催化一個帶有attB位點的DNA片段或表達克隆和一個帶有attP位點的供載體(donorvector)之間的重組反應,把目的片段及其兩端部分位點轉移至供載體中,創(chuàng)建一個入門克隆,其結構為attL1-基因-attL2。同時,供載體中的ccdB細胞死亡控制基因及其兩端部分位點被置換出來,單獨或融合到表達載體中而形成副產物。LR反應是利用由Int、IHF和由λ基因組編碼的切除酶(Xis)組成的LR克隆酶混和物催化一個帶有attL位點的入門克隆和一個帶有attR位點的目的載體之間的重組反應,使目的片段及其兩端部分位點取代目標載體(destinationvector)的ccdB基因及其兩端部分位點而產生最終的表達克隆,其結構為attB1-基因-attB2。副產物為帶有attP位點的供載體。LR反應作為Gateway克隆的主要反應,可用來在平行的反應中將一個或多個目的DNA片段在不同的表達平臺之間克隆、重組和轉移。目的DNA片段可以是cDNA、部分或完整的基因或者是基因組DNA,可通過用一對含有可利用酶切位點的特異引物進行PCR,限制性核酸內切酶的消化來制備,也可經由設計一對含有attB位點的基因特異引物進行PCR擴增獲得。Gateway技術作為一種強大且高效的體外操作系統,可應用于細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物以及慢病毒等系統中進行分析表達。自Gateway技術開發(fā)并商業(yè)化以來,在克隆基因及構建蛋白質表達載體等方面發(fā)揮了重要的作用。應用該技術,已成功克隆出擬南芥轉錄因子,在植物及病毒中構建表達載體也非常便捷。能夠進行與宿主無關的克隆及亞克隆是該技術的最大特點。由于在克隆的過程中,重組位點具有高度的專一識別性,使得重組反應后目的基因的方向和開放閱讀框能夠保持不變,而且陽性率高;克隆酶及位點的不同構成還可直接控制反應的方向。另外,這種新穎的多功能的通用系統也可用于蛋白質表達的優(yōu)化。因為蛋白質的成功表達和純化需要大量的宿主評估系統,沒有一個單一的表達系統適合所有蛋白質。優(yōu)化基因表達的最好方法是在多個系統中分析目的蛋白,通過比較分析,選定蛋白質表達的最佳方案。2.1.3u2004端突變的方法:酶切-連接-重組于2004年推出且擁有美國GeneCopoeia公司及其合資企業(yè)廣州復能基因有限公司自主知識產權的RecJoin專利克隆技術是對Gateway技術的一個發(fā)展,即目的基因與目的載體的結合處一端采用Gateway重組的方法,即目的載體一端保留attR位點;另一端采用經典克隆的方法,即另一端attR位點被替換成酶切位點的序列,克隆的步驟大致為“酶切-連接-重組”。此方法首先在重組att位點與目的DNA片段之間設計適宜數量的核苷酸以構成可利用且不影響基因與載體元件表達的酶切位點,它們與基因特異序列連在一起構成基因特異引物,與重組位點連在一起構成接頭引物,這樣利用兩步PCR將重組位點引入到目的基因的兩端,無需設計較長的含有att位點序列的基因特異引物。得到的線性DNA產物既可以用來進行BP反應構建入門克隆,而后通過RecJoin反應將目的基因裝入表達載體中而獲得最終克隆;也可以直接進行RecJoin反應獲得表達克隆。利用該技術構建的標簽-ORF融合蛋白表達克隆,由于標簽與ORF之間有時不會有重組位點,這樣就可以減少由于多余氨基酸的產生而對融合蛋白造成的影響。目前已有研究證實了運用此基因克隆技術對于相關目的蛋白表達的可靠性。2.2同源重組的影響同源重組是生物界普遍存在的生理現象,從噬菌體、細菌到真核生物都有能發(fā)生同源重組的種類。宏觀上講,它有助于增加生物體的變異程度,從而推動物種的進化;從微觀上看,它有利于細胞對體內壞基因的修復。如何把同源重組的方法應用到基因克隆中成為近年來國內外生物學家研究的熱點之一。2.2.1基于cy-pcr的同源替換重組質粒Li和Elledge在2005年首次報道了一種快速構建重組DNA分子的體內克隆基因的方法——MAGIC。此方法首先將攜帶含有目的DNA片段的供體質粒的一個細菌菌株和攜帶受體質粒的細菌菌株進行交配,使兩個質粒位于同一個細胞內;然后,供體和受體質粒經核酸內切酶Ⅰ——SceⅠ的消化,各形成兩個線性片段,進而催化同源替換重組,導致重組后該DNA片段受控于受體質粒中新的調控元件。不僅如此,Li和Elledge還利用電穿孔的方法將PCR產物轉化到受體細胞中經過MAGIC的模式獲得了該產物的表達克隆。在細菌、酵母和哺乳動物中,通過MAGIC的方法也均能獲得目的基因與其他元件構成的重組質粒表達的融合蛋白。MAGIC構建重組DNA不需要DNA的制備,也不需使用位點特異性重組酶,而且整合后非重組背景的水平較低。此方法最有前景的用途是全基因組中的基因操作。因為物種測序完成后,根據鑒定到的基因,能夠通過MAGIC的方法將它們轉換成任何表達文庫。這不僅有助于功能基因組學的研究,而且有助于從基因組工程到蛋白質組工程的研究。另外,Paddison等已運用該克隆方法成功構建了一系列短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的表達載體。2.2.2采用src催化同源重組Li和Elledge在2007年報道了一種不依賴基因序列和連接反應的SLIC基因克隆方法。此方法通過RecA介導的體外同源重組(invitrohomologousrecombination)和不依賴RecA的單鏈退火(single-strandannealing,SSA)途徑可以將DNA片段整合在一個反應體系中。體外同源重組過程利用T4DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性在插入片段以及載體片段的末端產生單鏈DNA突出末端,通過同源序列在體外完成交換重組,達到DNA片段的重新組合,進而完成基因克隆的目的。不僅如此,他們還發(fā)現了SILC可有效地同時將5個或者10個DNA片段整合在一起。SILC的應用,不僅避開了一些傳統重組方法對序列的要求,而且當在較低的DNA濃度時,用RecA催化同源重組依然能夠很有效地發(fā)揮其作用,這種靈活性將為今后的合成生物學研究重組DNA的產生提供更多的可能性。白帆等在2008年通過大腸桿菌的藍白菌落篩選和對重組子的酶切分析,驗證了利用SLIC方法克隆pUC18中的LacZ基因片段的可靠性,結果證明SLIC能夠使DNA片段在設計的位點處發(fā)生精確的重組。王中山等也通過SLIC的途徑克隆得到了大腸桿菌編碼細胞周質底物結合蛋白gsiB基因。2.2.3重組dna分子Gibson等在2009年報道了另外一種DNA體外重組方法——等溫的單反應方法。它要求在50℃條件下首先利用T5核酸外切酶5′端的外切活性在設計需要片段連接處產生單鏈DNA突出末端,然后利用PhusionDNA聚合酶和TaqDNA連接酶在單鏈DNA互補區(qū)域特異退火,從而將多個具有重疊區(qū)域的DNA分子重組在一起。這種整合方法在兩段線性DNA含有40bp以上的同源序列即可進行,不僅可用于無縫構建合成的或固有的基因,而且可以進行大片段DNA的人工合成,是一種非常有用的分子克隆工具。2.2.4序列抑制劑序列的序列構建及克隆技術流程Clontech公司出產的In-FusionPCRCloningKit和GenScript公司出產的CloneEZPCRCloningKit都是運用擁有各自專利的酶產品來進行線性DNA末端有15個堿基同源序列的多個目的片段的重組結合。二者原理基本相同,以In-Fusion方法為例,當發(fā)生PCR克隆時,來源于痘病毒的In-FusionDNA聚合酶通過其3′→5′外切核酸酶活性從3′端切除核苷酸,使PCR產物和載體末端暴露出具有重疊區(qū)域序列的單鏈突出末端,然后啟動SSA反應,快速將目的片段定向精確地插入到線性載體中,最后轉化到感受態(tài)細胞中通過修復產生出目的克隆。這也是一個無縫反應,不會另外添加其他的核苷酸。此克隆技術操作簡單方便,首先,通過限制性單酶切、雙酶切或PCR獲得線性載體,設計并合成與線性載體末端至少有15個堿基同源序列的基因特異引物,擴增目的基因;然后,加入DpnⅠ處理模板,膠回收獲得純化的PCR產物,與自備的線性載體以2∶1的摩爾比混和,加入In-Fusion酶和其指定緩沖液進行培育;最后,用TE緩沖液稀釋反應產物,轉化并篩選出目的克隆。整個反應通常只需要5~20ng的線性DNA即可進行,而且不論片段大小都有較高的重組效率,轉化后也很少會有非線性的載體背景出現。In-FusionPCR克隆是目前最為簡便有效的體外構建重組表達載體的DNA重組方法。整個過程不需要限制性酶、連接酶及磷酸酶,所以不用考慮目的片段中含有的特殊位點;而且不需要附加特定的重組位點,就能夠高通量的將任何插入片段克隆到任何自備載體中,這有助于實現分子克隆的自動化操作。研究人員已將該技術應用于炭疽桿菌蛋白質結構的研究、目的基因序列中引入點突變、融合蛋白表達載體的構建、抗體可變區(qū)的快速克隆及重組單克隆抗體的表達等方面。但是由于經濟成本的原因,許多科研人員目前都未把它當作大規(guī)模生產克隆的首選方法。2.2.5人工誘導克隆大多數已公布的克隆系統都需要涉及外源插入片段和載體的體外操作,而Olieric等在2010年則報道了一種自動快速且低成本的體內構建表達克隆的方法。該方法要求線性載體和插入片段的末端要有13~20個核苷酸的重疊區(qū)域,然后將經PCR擴增和膠純化的插入片段和經限制性內切酶消化并膠純化的線性載體以2.5∶1的質量比混合進行共轉化,在大腸桿菌感受態(tài)細胞內發(fā)生同源重組并整合成表達質粒。該研究使用的載體不但可以進行有插入片段的正向選擇或者是只有空載體分子的負向選擇,而且在N端和C端位置都有可利用的標簽,可以在大腸桿菌感受態(tài)細胞中啟動目的基因編碼蛋白質的高效表達。通過測試,將6個不同來源、長度及功能的靶序列克隆到8個上述載體中,結果靶蛋白被探測到有表達信號。由于該方法中在處理片段和載體這一步需要做膠回收,因此,這種方法還不能實現完全意義上分子克隆的自動化操作,但是此方法建立了共轉化和正負向選擇的自動克隆平臺,可像Gateway或LIC一樣作為高通量的克隆系統應用。綜上,這些基于重組的基因克隆技術建立了一個新的分子生物學的發(fā)展方向