高熱穩(wěn)定性極端酶的研究進(jìn)展

高熱穩(wěn)定性極端酶的研究進(jìn)展

在極端環(huán)境中有許多微生物。它們可以在火山口的高溫下生存，有些可以生長(zhǎng)在寒冷的極上，有些可以承受海底深度的高壓，有些可以在ph值為0.3或ph值為10.12的環(huán)境中生存，有些可以在5%-30%的環(huán)境中保持沉默。人們把這些適于生存在高溫、高壓、高酸、高堿以及高鹽濃度下的這一類(lèi)微生物稱(chēng)之為嗜極端微生物。最近10年,有許多的嗜高溫極端微生物被分離出來(lái),它們甚至可在沸水中生長(zhǎng)。最高生長(zhǎng)溫度達(dá)103～110℃的極端微生物包括Pyrobaculum、Pyrodictium、Pyrococcus以及Methanopyrus等種屬。在細(xì)菌中,Thermotogamaritima和Aquifexpyrophilus能生存的最高溫度分別是90℃和95℃。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60多種嗜熱的細(xì)菌和古細(xì)菌。它們包括好氧和厭氧的化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型菌和異養(yǎng)型菌。后者能夠利用多種多聚物,如淀粉、半纖維素、蛋白質(zhì)。這些微生物的代謝過(guò)程和特殊的生物學(xué)功能,是由在極端條件下的酶和蛋白質(zhì)的功能所決定的。從這些嗜熱極端微生物中分離出來(lái)的酶顯示了獨(dú)特的特性:具有極高的熱穩(wěn)定性,通常能抵抗化學(xué)變性劑如表面活性劑、有機(jī)溶劑和高酸高堿環(huán)境。其催化功能優(yōu)于目前在各種工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的酶。因此,可以將這些酶作為設(shè)計(jì)和構(gòu)建工業(yè)上具有新特性的蛋白質(zhì)的模型而加以應(yīng)用。本文主要討論嗜熱(最適生長(zhǎng)溫度70～80℃)及超嗜熱(最適生長(zhǎng)溫度85～100℃)微生物(古細(xì)菌和細(xì)菌)在生物工程中的重要意義,并將著重討論直鏈淀粉酶、支鏈淀粉酶、環(huán)化糊精糖基化轉(zhuǎn)移酶、纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶以及葡萄糖異構(gòu)酶、DNA聚合酶等胞內(nèi)多聚物降解酶,這些酶在食品、化學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)以及環(huán)境生物技術(shù)中具有很大的應(yīng)用潛力。1淀粉水解酶的分離和活性淀粉是由α-葡萄糖單元通過(guò)α-1,4或α-1,6糖苷鍵組成,分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。由于淀粉有復(fù)雜的結(jié)構(gòu),要降解淀粉需要多種酶。這些酶可被簡(jiǎn)單地分為2類(lèi):外切酶和內(nèi)切酶。內(nèi)切酶如α-淀粉酶(EC3.2.1.1),外切酶如β-淀粉酶(EC3.2.1.2)。能夠水解α-1,6糖苷鍵的酶被定義為支鏈淀粉酶或普魯蘭酶(EC3.2.1.41),根據(jù)其底物的特性,又可將普魯蘭酶分為I型和Ⅱ型,I型能特異性地水解支鏈淀粉和低聚糖的α-1,6糖苷鍵,Ⅱ型能夠水解支鏈淀粉、低聚糖及多糖的α-1,4和α-1,6糖苷鍵。長(zhǎng)期以來(lái),由于缺乏在100℃以上耐酸的高熱穩(wěn)定性酶,淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程必須在控制各種因素的條件下進(jìn)行。常規(guī)的多級(jí)生物處理工藝(第1步:pH6.0～6.5,95～105℃;第2步:pH4.5,60～62℃;第3步:pH7.0～8.5,55～60℃)常常伴隨著形成并非需要的高濃度的鹽類(lèi)。在最后一步需得到高濃度的高果糖漿,必須用昂貴的離子交換器除去鹽類(lèi)。因此具有高熱穩(wěn)定性的淀粉水解酶的發(fā)現(xiàn),對(duì)改進(jìn)工業(yè)淀粉轉(zhuǎn)化工藝是非常有意義的。來(lái)源于超嗜熱極端微生物的淀粉酶在100℃以上、適合的pH值下具有很高的活性。分離高熱穩(wěn)定性及具有嗜熱活性的酶的詳細(xì)研究已經(jīng)作了不少。來(lái)源于Pyrococcuswoesei,Pyrococcusfuriosus和Thermococcusprofundus的熱穩(wěn)定性α-淀粉酶已經(jīng)被鑒定,這些酶的最適活力溫度分別為100、100、80℃。在嗜熱極端微生物的一些種屬Sulfolobus、Desulfuroloccus、Thermococcus和Staphylothermus中也觀察到淀粉水解酶的活性。最近,一個(gè)來(lái)源于P.furiosus的編碼胞外α-淀粉酶的基因已經(jīng)被克隆,其重組酶已在Bacillussubtilis中進(jìn)行了表達(dá)。這個(gè)來(lái)自P.furiosus的胞外α-淀粉酶在缺乏多種離子的狀態(tài)下所表現(xiàn)的熱穩(wěn)定性(最高可在130℃中具有活性)以及其獨(dú)特的生產(chǎn)模式和底物特異性使它在工業(yè)應(yīng)用中備受矚目。來(lái)自P.furisus的編碼胞內(nèi)α-淀粉酶的基因也被克隆并且進(jìn)行了表達(dá)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),在一些淀粉酶中常常出現(xiàn)的4個(gè)高保守區(qū)域沒(méi)有在該淀粉酶中出現(xiàn)。目前,一些具有耐熱活性的α-淀粉酶已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),如來(lái)自Bacilluslicheniformis、T.maritima的淀粉酶通常被用于淀粉的液化作用,但后者的淀粉酶活性顯著依賴(lài)于Ca2+的存在。2普魯蘭酶型在Thermocococcuseler、Desulfurococcusmucosus、Staphylothermusmarinus及Thermococcusaggregans中,人們已經(jīng)分離出了具有高熱穩(wěn)性和嗜熱活性的普魯蘭酶。Cauganella等發(fā)現(xiàn),這些普魯蘭酶的最適溫度在90～105℃之間,甚至在缺乏底物和Ca2+的條件下,它們還有顯著的熱穩(wěn)定性。關(guān)于該酶的大多數(shù)研究著重于普魯蘭酶Ⅱ型。該酶已從P.furiosus和Thermococcuslitoralis中被分離純化。來(lái)自P.woesei的普魯蘭酶Ⅱ型的基因已在大腸桿菌中表達(dá),純化的重組酶的最適溫度為100℃,在110℃的條件下仍然具有一半活力。1997年Dong等將來(lái)源于P.furiosus的編碼普魯蘭酶Ⅱ型的基因在大腸桿菌中進(jìn)行了克隆和表達(dá)。這些具有嗜熱穩(wěn)定性的酶能水解α-1,4和α-1,6糖苷鍵,從而可以改進(jìn)工業(yè)上淀粉水解工藝。好氧嗜熱菌Thermuscaldophilus生產(chǎn)一種高熱穩(wěn)定性的普魯蘭酶I型,該酶的最適溫度為75℃,最適pH為5.5。在90℃以上依然有穩(wěn)定性,但它的穩(wěn)定性和活性并不依賴(lài)于Ca2+。1997年Koch等首次從一個(gè)厭氧耐熱菌Fervidobacteriumpennavorans中分離鑒定了普魯蘭酶I型。最近,編碼該酶的相關(guān)基因已在大腸桿菌中進(jìn)行了克隆和表達(dá)。與來(lái)自P.woesei的普魯蘭酶相比較,來(lái)自F.pennavoransVen5的普魯蘭酶專(zhuān)一性地水解多糖的α-1,6糖苷鍵。這是目前知道的唯一一種專(zhuān)一水解支鏈淀粉的嗜熱穩(wěn)定性支鏈淀粉酶,該酶通過(guò)水解支鏈淀粉可以形成長(zhǎng)鏈線(xiàn)性多糖,而后者是葡萄糖淀粉酶的理想底物。3環(huán)化糊精co-染色環(huán)化糊精糖基化轉(zhuǎn)移酶(CGTase)(EC2.4.1.19)以隨機(jī)的方式水解多糖的α-1,4鍵,并通過(guò)胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)糖基作用轉(zhuǎn)化淀粉,該反應(yīng)的非還原性環(huán)化產(chǎn)物包括α、β、γ-環(huán)化糊精,分別由6、7或8個(gè)葡萄糖分子組成。CGTase主要在工業(yè)上應(yīng)用于環(huán)化糊精的產(chǎn)生。CGTase可將多種有機(jī)分子聚集成包含復(fù)合體,這意味著該酶能在水溶液中提高疏水化合物的溶解性。環(huán)化糊精的生產(chǎn)由多級(jí)工藝步驟完成:第1步,淀粉被熱穩(wěn)定性淀粉酶液化;第2步,用來(lái)自Bacillussp.的CGTase進(jìn)行環(huán)化反應(yīng),因?yàn)镃GTase的穩(wěn)定性較差,該工藝過(guò)程必須在兩個(gè)不同的溫度下進(jìn)行。來(lái)自極端微生物的熱穩(wěn)定好、特異性高的CGTase將解決這個(gè)問(wèn)題。它可使液化作用和環(huán)化在同一步進(jìn)行。具有高熱穩(wěn)定性的CGTase已經(jīng)在Thernoamaerobactersp.中發(fā)現(xiàn),Wind等也從Thermoamaerobacterthermosulfurgenes中發(fā)現(xiàn)了該酶。最近Powe從肯尼亞的Bogoria湖中分離和鑒定了一個(gè)新的菌株Anaerobrancabogoriae,并在該菌株中分離純化了一個(gè)嗜熱、嗜堿的很穩(wěn)定的CGTase,其最適生長(zhǎng)溫度為65℃,pH為10。4其他纖維素酶纖維素占植物生物量的40%以上,它由葡萄糖單元通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成,其多聚物包括15000個(gè)葡萄糖單元,以完全線(xiàn)性模式存在。雖然纖維素有較高的親水性但它卻不易溶解。天然纖維素化合物結(jié)構(gòu)是非均質(zhì)性的,它既有非晶態(tài)區(qū)域也有有序的晶體區(qū)域,結(jié)晶的程度依賴(lài)于纖維素的來(lái)源和高晶體區(qū)域,該區(qū)域能夠抵抗酶的水解。纖維素水解為葡萄糖至少需要3種不同的酶的協(xié)同作用而完成,它們是:內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(纖維素水解酶)及β-葡萄糖苷酶。纖維素酶(EC3.2.1.4)廣泛存在于真菌和細(xì)菌中,并已經(jīng)應(yīng)用于多種生物工藝。目前在工業(yè)中廣泛應(yīng)用的是來(lái)自于Trichodermasp.的纖維素酶,該酶還可在Aspergillus、Penicillium和Basidiomycetes中得到。纖維素酶應(yīng)用于乙醇生產(chǎn)中可以提高產(chǎn)量,應(yīng)用于洗滌劑中可以使被清洗物顏色鮮艷柔軟,并有效去除特殊的油污。另一些纖維素酶可以應(yīng)用于飼料谷物的前處理以改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,工農(nóng)業(yè)廢料的纖維素酶化處理能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的化學(xué)產(chǎn)品。具有高熱穩(wěn)定活性的纖維素酶對(duì)晶態(tài)纖維素進(jìn)行高效水解在生物工程中應(yīng)用前景廣闊。已有一些來(lái)自超嗜熱微生物的纖維素酶的基因被克隆,重組酶也得到純化和鑒定。Bronnenmeiar將一種來(lái)源于T.maritimuMSB8的纖維素酶進(jìn)行了酶學(xué)特征分析。該酶分子質(zhì)量為4.455×10-17?kg,最適溫度為95℃。最適pH在6.0～7.0之間。另有兩個(gè)高熱穩(wěn)定性?xún)?nèi)切纖維素酶CelA、CelB可從Thermotognneapolitana中得以分離純化,CelA(4.785×10-17kg)的最適pH為6,最適溫度為95℃;CelB(4.95×10-17kg)有較寬的pH范圍,編碼這兩個(gè)內(nèi)切纖維素酶的基因已經(jīng)被鑒定。存在于嗜熱厭氧菌Caldocellumsaccharolytium基因組中編碼纖維素酶和半纖維素酶的基因是以基因簇的形式存在的,在該菌的培養(yǎng)中以纖維素和半纖維素作為碳源。編碼纖維素酶(CelA)的基因已被分離,該基因編碼1751氨基酸。這是目前為止知道的最大編碼纖維素酶的基因。來(lái)自T.maritimaMSB8的高熱穩(wěn)定性外切纖維素水解酶的分子質(zhì)量為4.785×10-17kg,最適溫度95℃,pH6.0～7.5,在95℃中有一半的活力。該酶能水解微晶纖維素、羧甲基纖維素和β-葡聚糖形成纖維二糖和纖維三糖。從Thermotogasp.F3SS3-BC中分離得到的纖維二糖酶有非常高的熱穩(wěn)定性,在115℃、pH6.8～7.8時(shí)有最大活力,該酶的熱穩(wěn)定性是依賴(lài)鹽的,該酶能降解非晶體狀態(tài)的纖維素和羧甲基纖維素。1991年,Grogen在sufolobussolfataricusMT4、Sulfolobusacidocalarius、sulfolobusshibatae中發(fā)現(xiàn)了β-糖苷酶,Kengen1993年在P.furiosus中也發(fā)現(xiàn)了該酶。在P.furiosus中的β-糖苷酶為同源四聚體(9.24×10-17?kg亞基),在102～105℃時(shí)非常穩(wěn)定并有最適活力,在100℃、3.5d和110℃、13h該酶有一半活力。來(lái)自S.solfataricusMT4的β-糖苷酶已被純化鑒定,該酶是一個(gè)同源四聚體(8.25×10-17?kg亞基),85℃以上時(shí)對(duì)各種變性劑有非常高的抵抗力,活力很高。編碼該酶的基因已經(jīng)在大腸桿菌中克隆和高效表達(dá)。5木聚糖酶n-fm木聚糖是一個(gè)非均質(zhì)的分子,是構(gòu)成半纖維素的主要多聚化合物。木糖的完全降解需要以下幾種酶的作用。即內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.18)、外切β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.37)阿拉伯糖酶(EC3.2.1.55)、葡糖醛酸阿拉伯糖木聚糖內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.136)、乙?；揪厶酋ッ?EC3.1.1.6),它們?cè)谏锛夹g(shù)中應(yīng)用廣泛,應(yīng)用于禽類(lèi)的飼料添加劑中可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,應(yīng)用于面粉中以提高烘烤產(chǎn)品的質(zhì)量。近幾年,高熱穩(wěn)定性的木聚糖酶主要應(yīng)用于造紙業(yè)中的酶輔助漂白技術(shù)中。在美國(guó),每年有超過(guò)2×106?t的氯及氯的衍生物被用于紙漿的漂白,氯化木質(zhì)素衍生物的產(chǎn)生給環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重的污染問(wèn)題。近來(lái)研究者已證實(shí)用耐熱木聚糖酶代替氯及其衍生物,可以避免污染問(wèn)題同時(shí)減少紙漿成分的損失。在高溫下,木聚糖酶可以打開(kāi)細(xì)胞壁,在漂白階段促進(jìn)木質(zhì)素的去除,而目前市場(chǎng)上的木聚糖酶在70℃以上時(shí)迅速變性,因此,用這些酶處理紙漿時(shí),必須先將紙漿冷卻處理后再加熱以進(jìn)行下一個(gè)工藝步驟,既浪費(fèi)時(shí)間和能量,又比較繁瑣。迄今為止,只發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種超嗜熱極端微生物能分泌具有高熱穩(wěn)定活力的木聚糖酶。其中大多數(shù)來(lái)自Thermotogasp.FjSS3-B.1、T.maritime、T.neapolitana以及Thermotogathermarum。這些酶主要在80～105℃具有酶活。幾個(gè)編碼木聚糖酶的基因已經(jīng)被克隆和測(cè)序,來(lái)自T.maritima的木聚糖酶基因在大腸桿菌中被克隆和表達(dá)。經(jīng)比較研究發(fā)現(xiàn),該酶比目前用于造紙業(yè)中的最好的木聚糖酶更具有應(yīng)用價(jià)值。6執(zhí)法性蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用目前所有的商用生物蛋白酶(EC3.4.1.1～3.4.4.25)根據(jù)其活性中心可分為以下幾種類(lèi)型:絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶及含金屬蛋白酶等。蛋白酶的生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量非常大,絲氨酸堿性蛋白酶用于日化用品可以抵抗去污劑和強(qiáng)堿條件下導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性。蛋白酶所顯示出的高角蛋白酶活性和酯酶活性在皮革工業(yè)中的浸透過(guò)程是非常有用的。蛋白酶還常用于肽鏈合成的催化過(guò)程及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。一些蛋白酶還可在高熱高堿條件下進(jìn)行催化反應(yīng),這在工業(yè)中的應(yīng)用很有價(jià)值。來(lái)源于古細(xì)菌的多種熱穩(wěn)定性蛋白酶已被分離鑒定。它們大多數(shù)屬于絲氨酸蛋白酶類(lèi)型,它們?cè)诟邷?、高濃度的去污劑以及變性劑存在的條件下穩(wěn)定性極好。來(lái)自DesulfurococcusSY的蛋白酶在95℃下培養(yǎng)4.3h依然有一半活性。來(lái)自T.stetteri的胞外蛋白酶分子質(zhì)量為11.22×10-17?kg,耐高熱、可抵抗化學(xué)變性劑,在100℃下培養(yǎng)2.5h有一半活性。一個(gè)編碼類(lèi)似枯草桿菌中性蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的基因已從Pyrobaculumaerophilum中克隆出來(lái),該酶被用作研究枯草桿菌中性蛋白酶基本結(jié)構(gòu)的模型。在Pyrococcusfuriosus中也觀察到絲氨酸蛋白酶活性。該蛋白酶具有很高的熱穩(wěn)定性,在105℃下培養(yǎng)20min有一半的活性。編碼該酶的基因已被克隆和測(cè)序,該酶也是一個(gè)類(lèi)似枯草桿菌中性蛋白酶的絲氨酸蛋白酶。來(lái)自嗜熱菌的F.pennavorans的一種高熱穩(wěn)定性的絲氨酸蛋白酶已被鑒定,該酶可以水解角蛋白,形成氨酸基和多肽,該酶的最適溫度為80℃,最適pH為10。除了絲氨酸蛋白酶以外,有些其它類(lèi)型的蛋白酶也被分離和鑒定。如來(lái)自Pyrococcussp.KOD1的巰基蛋白酶及來(lái)自P.furiosus的一種丙基多肽酶等7pcr擴(kuò)增極端基因的途徑DNA聚合酶(EC2.7.7.7)是DNA復(fù)制時(shí)的關(guān)鍵酶。目前有100多個(gè)從各種微生物中包括嗜熱極端細(xì)菌和古菌發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶的相關(guān)基因已經(jīng)被克隆和測(cè)序,幾種天然的和重組的DNA聚合酶已被純化鑒定。在近10年分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最重要的進(jìn)步之一就是PCR技術(shù)的問(wèn)世和發(fā)展。在PCR技術(shù)中,DNA聚合酶起著關(guān)鍵性的作用,Taq酶既是從棲熱菌Thermusaquaticus中分離純化而得到的第一個(gè)應(yīng)用于PCR的高熱穩(wěn)定性酶。然而Taq酶有5’-3’的外切活性,但是沒(méi)有3’-5’的外切活性,因此該酶不能很好地保證PCR產(chǎn)物的保真性。具高保真性的高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶近年已陸續(xù)出現(xiàn),這些酶普遍具有3’-5’外切核酸酶活性,如來(lái)自古細(xì)菌Pyrococcuswoesei的PwoDNA聚合酶,來(lái)自Pyrococcusfuriosus的PfuDNA聚合酶以及來(lái)自PyrococcusstrainGB-D和Thermuslitoralis的VentDNA聚合酶,與Taq