穗花杉隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna條件優(yōu)化

穗花杉隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna條件優(yōu)化

穗花杉是紅杉科的一種植物。這是中國(guó)特有的國(guó)家保護(hù)植物和第三個(gè)世紀(jì)的遺跡。它對(duì)研究中國(guó)南方植物區(qū)系的產(chǎn)生和發(fā)展具有重要的價(jià)值。由于穗花杉形狀獨(dú)特，生長(zhǎng)優(yōu)美，種子成熟，有鮮紅色的假種皮，材料優(yōu)良，因此可以作為優(yōu)良的園林觀賞樹種和材料樹種。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RandomamplifiedpolymirphismDNA,RAPD)分析是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的一種的分子生物學(xué)技術(shù),它具有引物可以隨機(jī)設(shè)計(jì)、所需DNA量少、操作技術(shù)簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于分析物種的遺傳多樣性.但由于其重復(fù)性、穩(wěn)定性較差,因此必須對(duì)其擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.本實(shí)驗(yàn)對(duì)穗花杉RAPD反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,旨在為后續(xù)遺傳多樣性的分析建立一個(gè)最優(yōu)的RAPD擴(kuò)增體系.1材料和方法1.1試驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)用穗花杉葉片采自江西宜豐官山.采后立即冰凍,帶回實(shí)驗(yàn)室洗凈、晾干后置于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?1.2pcr和upv-80凝膠成像系統(tǒng)TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司,Mg2+、dNTPs、隨機(jī)引物、λDNA/HindIII+EcorRIMarker和GeneRuler/100bpDNALadderPlusMarker均購(gòu)自上海生工公司;PCR儀為PTC-200型(美國(guó)MJResearch公司);電泳儀及電泳槽均由北京六一廠生產(chǎn);UPV-8000凝膠成像系統(tǒng)為Ultra-VioletProductsLtd生產(chǎn);2000型&UV-型分光光度計(jì)為尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn).1.3dna純度和含量的測(cè)定DNA的制備與定量參照CTAB改良法,稱0.125g新鮮葉片,用液氮研磨成粉狀,轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中.加入1mL、-20℃的丙酮,輕輕震蕩1min后于5000rpm離心10min,去上清后再重復(fù)上述丙酮處理一次.向管中加入預(yù)熱60℃的CTAB1mL,60℃溫育4h,后加入500μL氯仿∶異戊醇(24∶1),抽提10min后以13000rpm離心10min,取上清重復(fù)上述抽提直至不見蛋白沉淀.取上清加入2/3體積的冷異丙醇,輕輕混勻后,于2000～3000rpm離心3min.沉淀用70%的乙醇在室溫洗滌20min后,1000rpm離心10min.沉淀于室溫干燥后用50μLTE緩沖液溶解.采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度和含量.1.4rapd反應(yīng)條件設(shè)置本實(shí)驗(yàn)選用引物S41(ACCGCGAAGG)對(duì)各反應(yīng)因素進(jìn)行優(yōu)化.(1)模板DNA含量對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)中設(shè)置模板含量梯度分別為15,25,35,50,70,100,130ng.(2)TaqDNA聚合酶含量對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)中設(shè)置酶含量梯度分別為0.5,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5U.(3)Mg2+濃度對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)中設(shè)置Mg2+濃度梯度分別為1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0mmol/L.(4)dNTP濃度對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)中設(shè)置dNTP的濃度梯度分別為0.15,0.20,0.25,0.30,0.35mmol/L.(5)引物濃度對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)中設(shè)置引物濃度梯度分別為0.15,0.30,0.45,0.60,0.75,0.90μmol/L.以上除擴(kuò)增反應(yīng)變量外,其余試劑的用量及反應(yīng)條件為:模板量70ng、2×Taq酶buffer2μL,0.2mmol/LdNTP、2.5mmol/LMg2+濃度、1.5UTaq酶、0.45μmol/L引物.擴(kuò)增反應(yīng)完成后,取10μL的產(chǎn)物在1.4%的瓊脂糖凝膠上,1×TBE緩沖液中電泳,穩(wěn)壓電泳2h左右,Marker作分子量標(biāo)準(zhǔn),用凝膠成相儀拍照檢測(cè).2結(jié)果與分析2.1種方法所提基因組dna含量和純度DNA的檢測(cè)用改良CTAB對(duì)穗花杉基因組進(jìn)行提取,經(jīng)電泳分析顯示其大小為23kb左右(圖1,M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物,以下同).通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA含量和純度.本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了幾種處理方法對(duì)基因組DNA提取的影響,結(jié)果表明:與未用丙酮進(jìn)行前處理相比,提取穗花杉基因組DNA采用丙酮前處理去除色素,所得提取產(chǎn)物基因組DNA物純度較高,故在提取基因組DNA前用丙酮進(jìn)行處理.同時(shí)研究表明,在2～4h范圍內(nèi),CTAB抽提時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)提取的基因組DNA產(chǎn)量和純度影響不大.2.2pcr擴(kuò)增結(jié)果RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在RAPD分析時(shí),不同植物所需的模板DNA量各不相同.為確定穗花杉RAPD擴(kuò)增反應(yīng)所需最適模板DNA量,本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置了7個(gè)模板DNA含量梯度進(jìn)行優(yōu)化.由PCR擴(kuò)增結(jié)果可知(圖2),在模板含量為15ng和25ng時(shí),電泳圖譜未見有擴(kuò)增條帶.在35,50,70ng時(shí),電泳圖譜可見清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶.隨著模板DNA量繼續(xù)增加,電泳圖譜上擴(kuò)增條帶彌散不清晰.一般認(rèn)為模板濃度在一定范圍內(nèi)不會(huì)影響擴(kuò)增條帶的數(shù)量,即不會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增位點(diǎn)的增減,但對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)量有影響,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致.因此根據(jù)上述結(jié)果,確定穗花杉RAPD反應(yīng)采用50～70ng的模板即可.2.3電泳帶型的表征RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)和量與TaqDNA聚合酶的含量密切相關(guān),酶含量的高低直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的效果.TaqDNA聚合酶含量過(guò)高時(shí)會(huì)有小片段產(chǎn)生,從而使電泳帶型呈現(xiàn)彌散狀態(tài),背景非常嚴(yán)重;TaqDNA聚合酶含量過(guò)低則導(dǎo)致擴(kuò)增條帶太弱.在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)酶含量為0.5U,電泳圖譜上沒(méi)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;在0.8～2.5U,電泳圖譜上擴(kuò)增產(chǎn)物條帶穩(wěn)定,清晰;隨著酶濃度的增加,電泳圖譜上擴(kuò)增產(chǎn)物條帶數(shù)不清晰(圖3).從實(shí)驗(yàn)效果及節(jié)約實(shí)驗(yàn)費(fèi)用的角度考慮,穗花杉RAPD反應(yīng)體系宜采用酶含量為1.5U.2.4mg2+對(duì)taqcda聚合酶的影響在本實(shí)驗(yàn)中,Mg2+濃度在1.0～2.5mmol/L時(shí),電泳圖譜上擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰且穩(wěn)定,但在2.0mmol/L擴(kuò)增產(chǎn)量最大.隨著Mg2+濃度的增大,擴(kuò)增產(chǎn)物量較少(圖4).產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能為:(1)Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑,其濃度的變化將影響酶活性,在Mg2+的濃度較低時(shí),Taq酶可結(jié)合的游離Mg2+相對(duì)來(lái)說(shuō)較少,酶活力較低,因而擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物較少.(2)Mg2+可和RAPD擴(kuò)增反應(yīng)混合物中DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)相結(jié)合,當(dāng)Mg2+濃度高到一定程度時(shí),會(huì)拮抗dNTP和模板的有效含量,最終影響擴(kuò)增結(jié)果.2.5dntp濃度對(duì)擴(kuò)增條帶的影響dNTP作為PCR反應(yīng)的原料,其濃度的大小直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)量和穩(wěn)定性.在0.15～0.25mmol/L時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物量較高,可見明顯的擴(kuò)增條帶,這與一般文獻(xiàn)報(bào)道的dNTP適宜濃度為0.20mmol/L相一致.隨著dNTP濃度增加,條帶模糊不清.產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能為:dNTP是反應(yīng)中磷酸的主要來(lái)源,能與鎂離子相結(jié)合.當(dāng)dNTP濃度較低時(shí),由于與鎂離子的結(jié)合而使其本身有效濃度更低,導(dǎo)致擴(kuò)增量減少;當(dāng)dNTP濃度較高時(shí),dNTP與鎂離子相結(jié)合又會(huì)降低反應(yīng)液中游離鎂離子的濃度,從而影響酶的有效活力.本實(shí)驗(yàn)確定dNTP濃度為0.25mmol/L.2.6引物濃度對(duì)非特異性pcr擴(kuò)增的影響設(shè)置6個(gè)引物濃度梯度進(jìn)行了分析(圖6).當(dāng)引物濃度較低時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物量少;在0.30～0.60μmol/L時(shí)帶型清晰,背景較淺;隨著引物濃度的增加,非特異性擴(kuò)增表現(xiàn)非常明顯,電泳條帶變得模糊.這是因?yàn)橐餄舛冗^(guò)低,無(wú)法與所有的模板DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不理想;引物濃度過(guò)高時(shí),會(huì)促使引物錯(cuò)誤地引導(dǎo)非特異性產(chǎn)物的合成,非特異性產(chǎn)物和引物二聚體均為PCR反應(yīng)的底物,與靶序列競(jìng)爭(zhēng)DNA聚合酶和底物dNTP,均使靶序列擴(kuò)增量降低,而出現(xiàn)非特異條帶.本實(shí)驗(yàn)確定引物濃度應(yīng)采用0.60μmol/L.2.7預(yù)變性時(shí)間的確定RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響(1)退火溫度對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:本實(shí)驗(yàn)對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)中的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化,設(shè)置了4種退火溫度(分別為33,35,37和40℃).只有在37℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶穩(wěn)定而清晰、重復(fù)性好.33℃和35℃時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物條帶模糊不清,產(chǎn)量也低(圖7).當(dāng)退火溫度為40℃,電泳圖譜上基本不見擴(kuò)增產(chǎn)物條帶.因此確定退火溫度為37℃.(2)預(yù)變性時(shí)間對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的影響:本實(shí)驗(yàn)對(duì)模板DNA擴(kuò)增前的預(yù)變性時(shí)間也設(shè)置了梯度比較,在94℃條件下,對(duì)模板預(yù)變性時(shí)間處理1,2,3,4,5和6min,擴(kuò)增效果見圖8.模板預(yù)變性時(shí)間為4～5min時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮.模板預(yù)變性時(shí)間為6min時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶缺失,可能由于高溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng),TaqDNA聚合酶的活性造成損失.本實(shí)驗(yàn)確定預(yù)變性時(shí)間為5min.2.8穗花杉rapd最佳擴(kuò)增程序在以上優(yōu)化的條件下,本實(shí)驗(yàn)利用6個(gè)樣本對(duì)引物S40～S160共120條引物進(jìn)行了篩選.其中引物S41、S42、S59、S60、S67、S68、S77、S91、S92、S99、S100、S102、S103、S104、S110、S111、S114、S126、S136、S137等引物擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性,帶型