河南省部分地區(qū)prv新流行株的毒力測定與分析

河南省部分地區(qū)prv新流行株的毒力測定與分析

偽?。╬se）是由偽病毒?。╬sv）引起的急性傳染病。臨床上以發(fā)熱、瘙癢和腦損傷為特征。多種家畜和野生動物均可感染,以豬發(fā)病后危害最為嚴(yán)重,可致使妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及木乃伊胎,并造成返情比例增高,公豬則表現(xiàn)為睪丸炎,種用性能降低或喪失。PRV屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)α-皰疹病毒亞科,基因組為線狀雙股DNA,毒力由幾種基因協(xié)同控制,其中胸腺激酶(TK)和糖蛋白gE對毒力表達(dá)具有決定性的作用。TK基因與病毒在機(jī)體中的潛伏感染和在神經(jīng)組織中的增殖有關(guān),一旦失活,病毒毒力將喪失或明顯降低。gE基因則決定PRV從細(xì)胞上釋放和細(xì)胞間傳播,并促進(jìn)其進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和在其中轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散,這對PRV的毒力至關(guān)重要。多年來,中國堅持應(yīng)用基因缺失活疫苗配合野毒感染監(jiān)測技術(shù)來防制該病,取得了卓越成效,危害一度曾被養(yǎng)豬業(yè)忽視。2011年初至今,PRV又在中國豬場中出現(xiàn)大面積感染現(xiàn)象,一些常年監(jiān)測為陰性的豬場,短短數(shù)月內(nèi)豬群突然間轉(zhuǎn)為陽性,其中母豬群陽性率可達(dá)到30%~40%,中大豬幾乎100%陽轉(zhuǎn),疫情并有日趨擴(kuò)大和加重之勢。河南省及其周邊省份是中國養(yǎng)豬集聚區(qū),年出欄量多年穩(wěn)居全國前列,也是此次疫情發(fā)生和流行最為嚴(yán)重的區(qū)域之一,損失慘重。究竟是何種原因引起豬群中PRV突然大面積感染和疫情快速反彈,是當(dāng)前獸醫(yī)界和養(yǎng)豬業(yè)迫切需要解決的一個重大問題。本研究旨在通過PRV野毒感染監(jiān)測和新流行毒株主要毒力基因的分子特征開展研究,以期對病因進(jìn)行探索,為該病針對性防制措施的制定提供參考。試驗(yàn)豬和試劑待檢樣品為2011年1月至2013年5月間河南省及周邊省份(山西省、山東省和安徽省)的886個豬場送檢的血清,共計16800份。其中規(guī)?；i場血清共14005份,包括經(jīng)產(chǎn)母豬血清6582份,成年公豬血清1190份,后備豬(包括公、母豬)血清2705份,商品豬3528份;中小型豬場血清共2795份,包括經(jīng)產(chǎn)母豬血清1764份,成年公豬血清170份,后備豬(包括公、母豬)血清185份,商品豬676份。待檢病料采集自127個豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)監(jiān)測呈陽性的豬場送檢的905份發(fā)病仔豬的小腸組織,凍存待用。PRVgE抗體ELISA檢測試劑盒購自美國IDEXX生物科技有限公司,PRVELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司。DNA提取試劑盒由北京百泰克公司提供;ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T載體和DL2000Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司;PR基因工程缺失活疫苗購自某生物制品廠,每頭份中Bartha-K61株病毒含量≥105.5TCID50。應(yīng)用PRVgE抗體ELISA檢測試劑盒對送檢血樣進(jìn)行PRV野毒感染檢測。4ge、tk基因檢測2011~2013年從河南省及周邊省份發(fā)病豬場送檢的疑似病料中分離到11株P(guān)RV新流行毒株,分別在PKl5細(xì)胞上連傳5~8代,出現(xiàn)典型細(xì)胞病變后備用。各毒株的毒價測定按參考文獻(xiàn)進(jìn)行。選取毒力最強(qiáng)的2株P(guān)RV新流行毒株(NYXY株和PYQF2013株)進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn),即是將20頭試驗(yàn)豬只分為5組,每組4頭,其中1、2組為試驗(yàn)組,第3、4、5組為對照組。第1、2組分別頸部肌肉注射所購商品疫苗1頭份/頭,第3、4組為攻毒對照組(不免疫只攻毒),第5組為正常對照組(不免疫不攻毒)。免疫4周后采血并分離血清,應(yīng)用PRVELISA抗體檢測試劑盒檢測抗體,記錄檢測結(jié)果。免疫4周后進(jìn)行攻毒,攻毒劑量為每頭仔豬肌肉注射3ml,同時滴鼻3ml。每頭仔豬于攻毒當(dāng)日稱重,3周后再稱重,逐日觀察3周,記錄各組豬只臨床反應(yīng)情況,根據(jù)仔豬發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)計算保護(hù)率。根據(jù)GenBank收錄的PRVgE、TK基因序列,應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件分別設(shè)計引物,由上海生工生物工程公司合成。gE基因擴(kuò)增引物為P1:5-gagaccatgcgacccttt-3,P2:5-gtggggatgtcggaatgc-3,預(yù)計擴(kuò)增片段長度約為1787bp,包括一個從ATG到TAA的完整gE閱讀框。TK基因擴(kuò)增引物為P3:5-atgcgcatcctccggatctacctc-3,P4:5-tcacacccccatctccgacgtg-3,預(yù)計擴(kuò)增片段長度約為963bp。gE基因檢測用引物為P5:5-ttggatccctttccgccgagacgaccc-3,P6:5–cggaagcttcgcgggtggtagatgcag-3,預(yù)計擴(kuò)增片段長度約為808bp。取11株P(guān)RV新流行毒株培養(yǎng)液,按照DNA提取試劑盒說明書操作,分別提取總DNA,并按照以下參數(shù)進(jìn)行g(shù)E、TK基因的PCR擴(kuò)增:gE基因的PCR反應(yīng)總體積為50μl,其中ddH2O13μl,2×GCbuffer25μl,模板2μl,dNTP混合物7μl,P1和P2各1μl,ExTaqDNA聚合酶1μl。反應(yīng)條件為96℃5min,95℃50s,58℃1min,72℃2min,35個循環(huán);72℃10min。TK基因的PCR反應(yīng)總體積為50μl,其中ddH2O15μl,2×GCbuffer25μl,模板3μl,dNTP混合物4μl,P3和P4各1μl,ExTaqDNA聚合酶1μl。反應(yīng)條件為98℃5min;96℃30s,56℃1min,72℃2min,35個循環(huán);72℃10min。上述各PCR產(chǎn)物膠回收純化后與pMDl8-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5a,提取陽性質(zhì)粒送至上海生工生物工程公司測序,每個樣本測序兩次。并運(yùn)用DNAStar軟件包中的MegAlign程序,將測定的各序列與不同年代的PRV中國參考毒株進(jìn)行同源性比較,并應(yīng)用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對送檢的905份用于“返飼”的腸道組織分別用PBS緩沖液5倍稀釋,去除筋腱等結(jié)締組織,使用組織搗碎儀將其制成勻漿,反復(fù)凍融3~4次,以4℃8000r/min離心5min取上清,提取病料總DNA,按以下參數(shù)進(jìn)行g(shù)E基因檢測:反應(yīng)總體積為50μl,其中ddH2O12.5μl,2×GCbuffer25μl,模板8μl,dNTP混合物1μl,P5和P6各1.25μl,ExTaqDNA聚合酶1μl。反應(yīng)條件為97℃5min;95℃1min,58℃1min,72℃1min,35個循環(huán);72℃10min。各PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。選取養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的10個國內(nèi)外獸醫(yī)生物制品廠家不同批次的56份PR基因缺失活疫苗,按參考文獻(xiàn)測定效價。分別用PBS緩沖液10倍稀釋上述疫苗,提取總DNA,按照以下參數(shù)進(jìn)行g(shù)E基因檢測:ddH2O18.5μl,2×GCbuffer25μl,模板2μl,dNTP混合物1μl,P5和P6各1.25μl,ExTaqDNA聚合酶1μl。反應(yīng)條件為97℃5min;95℃1min,58℃1min,72℃1min,35個循環(huán);72℃10min。各PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。結(jié)果1血清總陽性率對4省份886個豬場送檢的16800份豬血清進(jìn)行PRV野毒感染檢測(表1),其中陽性檢出場為603個(68.06%),陽性血清數(shù)為6463份(38.47%),以河南省陽性場檢出率和血清總陽性率最高,分別為70.16%和40.08%,其他3省份分別為61.27%~69.17%和32.46%~39.01%。種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的血清總陽性率分別為40.12%、30.88%、54.67%和26.52%(表2)。其中規(guī)?；i場總陽性率為40.20%,種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的陽性率分別為42.11%、32.35%、56.19%和27.01%;中小型豬場總陽性率為29.80%,種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的陽性率分別為32.65%、20.59%、32.43%和23.96%。調(diào)查結(jié)果表明,河南省及周邊省份不同規(guī)模、不同階段豬群中均存在著嚴(yán)重的PRV野毒感染。4prv野毒污染檢測在送檢的905份腸道組織中,共檢測出PRV野毒陽性樣品366份,陽性檢出率高達(dá)40.44%,說明存在著嚴(yán)重的PRV污染(表5)。56份疫苗樣品中,檢測出PRV野毒陽性樣品0份,說明當(dāng)前市售PR基因缺失活疫苗中并不存在PRV野毒污染(表5)。56份PR基因缺失活疫苗中,每頭份的病毒含量均≥105.0TCID50,遠(yuǎn)高于規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)的5000TCID50,說明當(dāng)前市售疫苗的效價普遍很高,依然有效。適用疫苗的毒力基因PR是危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一,曾在本世紀(jì)初于中國大面積暴發(fā)疫情,自2003年起,以BarthaK-61株和HB-98株為代表的基因工程缺失疫苗廣泛投入使用,同時結(jié)合野毒感染監(jiān)測技術(shù),使得PRV的感染率和危害在隨后很長一段時間內(nèi)顯著降低。周緒斌等(2007年)對全國11個省市規(guī)?；i場進(jìn)行PRV野毒感染監(jiān)測,總陽性率僅為14.8%,種豬群陽性率為18.2%,其中河南省陽性率為16.0%;程晶等(2009年)對2006~2008年間我國部分地區(qū)規(guī)模化豬場開展PRV野毒感染監(jiān)測,總陽性率為23.40%,其中河南省僅為8%;莊金山等(2010年)對河南省規(guī)?；i場PRV野毒感染監(jiān)測結(jié)果表明,種豬陽性率僅為8.42%,仔豬和生長豬陽性率分別為11.54%和8.97%。本研究中,河南省及周邊省份PRV野毒感染陽性豬場檢出率高達(dá)68.06%,血清總陽性率為38.47%,種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的陽性率分別上升至40.12%、30.88%、54.67%和26.52%,表明2011年后該區(qū)域豬群中的PRV野毒感染率大幅攀升。PRV野毒感染率大幅上升時,首先要考慮病毒的主要毒力基因是否發(fā)生變異或疫苗中是否普遍污染強(qiáng)毒。將6株P(guān)RV新流行毒株的TK基因與不同年代的中國參考毒株進(jìn)行比較分析,核苷酸和氨基酸的同源性分別高達(dá)98.9%和97.5%以上,這些毒株都具有皰疹病毒TK家族的兩個活性中心,ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域由3個氨基酸殘基形成一個疏水的袋狀構(gòu)象,這3個氨基酸序列對皰疹病毒的毒力有很大影響,若其中3個甘氨酸殘基(G)中有一個發(fā)生突變,就會影響TK蛋白的構(gòu)象及其與ATP的結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致TK蛋白活性喪失。核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域在所有皰疹病毒中最為保守,其中的天冬氨酸殘基是結(jié)合Mg-NTP的前體,其前有一疏水的B-折疊片,天冬氨酸殘基對TK蛋白的催化活性極其重要。gE基因第125位(半胱氨酸)、126位(纈氨酸)的氨基酸缺失,可打斷gE/gI復(fù)合體的結(jié)構(gòu),以致滅活gI和gE復(fù)合體的功能,它們的突變或缺失與整個gE基因缺失一樣可降低毒力。8株P(guān)RV新流行毒株的gE基因與參考毒株的核苷酸同源性很高,推導(dǎo)的氨基酸序列僅在個別位點(diǎn)發(fā)生變異,但上述2位氨基酸都沒有發(fā)生異常改變,表明其毒力未出現(xiàn)明顯變異,可推定這些當(dāng)前流行的新毒株均屬于強(qiáng)毒,毒價測定結(jié)果證實(shí)它們的毒力較經(jīng)典毒株變化不大。gE蛋白N端的第33~100位氨基酸區(qū)段具有高度的抗原性和免疫原性,新流行毒株和參考毒株的氨基酸在該區(qū)都非常保守,因此突變位點(diǎn)的氨基酸對抗原性影響并不顯著,提示當(dāng)前的疫苗應(yīng)能有效抵御這些強(qiáng)毒株的攻擊,免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果也有力的支持了這一觀點(diǎn)。但PRV的毒力由多種基因協(xié)同控制,因此針對其他毒力基因的研究仍需進(jìn)一步開展。鑒于疫苗中必須缺失gE基因,因此在疫苗或疑似病料組織中檢測到gE基因陽性即可判定為污染PRV強(qiáng)毒。56份疫苗樣品中,PRV野毒檢出率為0%,證明現(xiàn)用疫苗中并未普遍存在野毒污染。因此,病毒變異和疫苗污染野毒可能不是造成2011年后該區(qū)域PRV野毒大面積感染豬群的主要原因。筆者長期從事豬病臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室研究工作,發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)豬實(shí)際生產(chǎn)中,一般只對生產(chǎn)母豬和商品豬進(jìn)行監(jiān)測,種公豬的野毒感染檢測幾乎為空白。實(shí)際上只要部分種公豬感染PRV野毒,便可通過精液在母豬群中迅速擴(kuò)散。因此,我們建議疫情嚴(yán)重的豬場送檢種公豬血清進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)總陽性率高達(dá)30.88%,其中規(guī)?；i場為32.35%,中小型豬場為20.59%,部分豬場甚至100%帶毒。這一研究結(jié)果與以往中小型豬場的PRV野毒感染率多高于規(guī)?；i場的傳統(tǒng)觀點(diǎn)相反,其原因應(yīng)是規(guī)模化豬場采用人工授精技術(shù),種公豬使用年限較長,感染野毒機(jī)會相對較多,加之多數(shù)種公豬富有攻擊性,難以接近,使得規(guī)?；i場的技術(shù)人員責(zé)任心不如以家庭式養(yǎng)殖為模式的中小型豬場畜主強(qiáng),疫苗接種的確切性難以落實(shí)到位。后備豬群中陽性率高達(dá)54.67%,規(guī)?；i場帶毒率明顯高于中小型豬場,表明存在著極為嚴(yán)重的PRV野毒感染。后備豬在引入或留種時,應(yīng)100%進(jìn)行PRV野毒檢測,但實(shí)際上該工作在生產(chǎn)實(shí)踐中形同虛設(shè),加之豬場多把后備豬與育肥豬混養(yǎng),更進(jìn)一步增加了野毒感染機(jī)率。由于PRV為皰疹病毒,感染后備豬后可長期甚至終身帶毒,通過水平或垂直傳播方式使得豬群總感染率快速上升。自2010年冬季至今,以PEDV為主要致病因素的新生仔豬急性腹瀉疫情在國內(nèi)廣泛流行,已成為豬場常發(fā)傳染病之一,是當(dāng)前造成仔豬高死亡率的最主要原因。由于當(dāng)前PEDV流行毒株極難分離,主要免疫原性基因相比于疫苗毒株CV777,也已發(fā)生較大變異,使得現(xiàn)有商品疫苗并不能產(chǎn)生確切的免疫效果。因此,近兩年來絕大多數(shù)豬場在發(fā)生疫情時,均通過使用病死仔豬的腸內(nèi)容物飼喂母豬進(jìn)行“強(qiáng)毒返飼”,使之產(chǎn)生高水平母源抗體以通過天然被動免疫的方式來保護(hù)初生仔豬,短期內(nèi)取得了良好效果。但隨之而來的問題是,妊娠母豬接種PR疫苗可有效阻止感染后出現(xiàn)臨診表現(xiàn),但仍有可能被野毒感染形成潛伏,而潛伏感染的病毒一旦被激活即可引起散播,這種“潛伏-激活”循環(huán)機(jī)理決定了PRV在種豬群中持續(xù)存在,并可通過垂直傳播使病毒侵入胎兒,造成新生仔豬長期的嚴(yán)重帶毒,使其消化道和免疫器官功能不健全,當(dāng)各類消化系統(tǒng)致病因子侵入消化道時,便會出現(xiàn)共同癥狀為腹瀉,使疫情更為嚴(yán)重和復(fù)雜化。本研究證實(shí)在用于“返飼”的新生仔豬腸道組織中,PRV野毒陽性檢出率高達(dá)44.09%,污染極為嚴(yán)重,而豬自然感染本病的傳播途徑主要是口腔與鼻道,因此這應(yīng)是該區(qū)域豬群中PRV野毒感染率大幅升高的另一個重要原因。根據(jù)以上研究結(jié)果,筆者認(rèn)為種公豬、后備豬普遍帶毒和PEDV“返飼”病料中嚴(yán)重污染PRV野毒,是造成當(dāng)前河南及周邊省份豬群中PRV大面積感染和疫情快速反彈的主要原因。因此建議各豬場應(yīng)廣泛開展種公豬和后備豬PRV帶毒狀況監(jiān)測預(yù)警工作,完全掌握其健康狀況,一旦發(fā)現(xiàn)陽性病例,立即淘汰,從源頭上加強(qiáng)防控;同時開展PEDV“返飼”病料中PRV野毒的檢測,若結(jié)果呈陽性,應(yīng)立即進(jìn)行滅活或停止使用。1樣本來源2測試試劑盒和主要試劑3野中毒的檢測5引用設(shè)計6ge和tk基因的pcr擴(kuò)增和序列分析7飼料中prv野毒感染的檢測8測定了疫苗的有效性和prv中野毒污染2pr抗體檢測根據(jù)Reed-Muench方法計算,11株P(guān)RV新流行毒株的毒價為10-6.21~10-7.85TCID50,均屬于強(qiáng)毒株,但細(xì)胞毒力較經(jīng)典毒株變化不大(表3)。2個試驗(yàn)組應(yīng)用疫苗免疫豬4周后檢測PR抗體,S/N比值為0.176~0.225(抗體陽性標(biāo)準(zhǔn)為S/N比值≤0.6),攻毒后在觀察期內(nèi)均未發(fā)病,無任何不良反應(yīng)。2組攻毒對照組的仔豬在攻毒后3d均出現(xiàn)體溫反應(yīng)(40.8℃~41.8℃),且持續(xù)6~7d,并伴有食欲減退或廢絕現(xiàn)象,發(fā)病率為100%(8/8),正常對照組無任何不良臨床反應(yīng)。研究結(jié)果證明現(xiàn)有疫苗可完全抵抗PRV新流行毒株的攻擊,保護(hù)率為100%(表4)。3prv新流行毒株的毒力基因序列及進(jìn)化分析將所測定的11株P(guān)RV新流行毒株的gE、TK基因分別提交至GenBank(表3)。其中8株P(guān)RV的gE基因長度均為1787bp,彼此間核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.