肝細胞生長因子對后路固定大鼠腓腸肌細胞凋亡的影響

肝細胞生長因子對后路固定大鼠腓腸肌細胞凋亡的影響

肝生長因子（hgf）是間質細胞產生的一種多功能因素。它可以調節(jié)細胞的生長和運動，對胚胎、組織的生長、肝臟和腎臟的再生、腫瘤的轉移和損害的修復起著重要作用。近年來,有學者發(fā)現HGF也是已發(fā)現的促衛(wèi)星細胞生長因子中唯一能激活靜止期衛(wèi)星細胞的生長因子,能使處于靜止期的骨骼肌衛(wèi)星細胞退出G0期,進入S期開始分裂,比其它生長因子的增殖作用更為明顯更適合于臨床。本實驗旨在觀察HGF對大鼠后肢固定后腓腸肌超微結構、骨骼肌細胞凋亡的影響,探討其對骨骼肌廢用性萎縮恢復的作用機制,為今后的理論研究和臨床治療提供依據。1材料和方法1.1動物飼養(yǎng)與使用雄性Wistar大鼠24只(200～250g),由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供,隨機分為正常對照組、模型組和實驗組,每組各8只,均在同一實驗室飼養(yǎng),按照南方醫(yī)科大學實驗動物飼養(yǎng)與使用規(guī)定進行。將模型組、實驗組按照Jozsa等的方法,將大鼠右后肢用可塑性石膏由足跖管型固定至膝上1cm處,膝關節(jié)固定于屈曲位100°,踝關節(jié)固定于跖屈60°,以使小腿肌肉保持松弛位。實驗組于制動當日起將肝細胞生長因子(HGF,廣東陽江制藥有限公司)按大鼠體重10mg/kg溶于1ml生理鹽水注射入大鼠腓腸肌,每天1次,模型組注射等量生理鹽水,正常對照組不做任何處理。四周后,由肌肉的起點至止點完整取出大鼠右后肢腓腸肌,進行相應指標檢測。1.2骨骼肌細胞凋亡和bcl-2單克隆抗體的檢測各組織標本以多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、HE染色,光鏡觀察;電鏡標本以30g/L戊二醛-10g/L鋨酸雙重固定,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛電子染色,透射電鏡觀察;骨骼肌細胞凋亡的測定采用DNA末端原位標記法(TUNEL法,試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司),嚴格遵照試劑盒說明書實驗步驟進行操作,最后顯微鏡下控制顯色,中性樹脂封片。于400倍光鏡下觀察,凋亡骨骼肌細胞的胞核呈深淺不一的棕黃色;bcl-2單克隆抗體的測定采用免疫組化染色法(免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司),染色模式為胞質或胞膜,于200倍光鏡下觀察,棕黃色顆粒表達為bcl-2陽性細胞;每張切片取相鄰10個視野,計數10個視野的陽性細胞數量,取其平均數作為每個切片的陽性細胞數(兩種方法樣本量均為每組8張切片)。1.3統計處理數據處理使用spss10.0。所有數據均以xˉ±sxˉ±s表示,多組間兩兩比較用t檢驗。2結果2.1he染色光顯微鏡觀察模型組肌纖維排列紊亂并伴有膠原纖維瘢痕形成;實驗組肌纖維再生比較完全,基本未見纖維瘢痕。2.2超微結構電鏡觀察模型組可見肌漿網擴張,線粒體腫脹、空腔化;實驗組線粒體基本無腫脹,空腔化少,肌漿網擴張少。2.3各組陽性細胞凋亡的比較TUNEL法在正常對照組中偶見散在凋亡骨骼肌細胞,模型組凋亡肌細胞呈強陽性表達,細胞核呈深淺不一的棕黃色,實驗組較模型組明顯減少(圖1:A為模型組、B為實驗組,見封3)。實驗組、正常對照組和模型組的陽性細胞凋亡數分別為20.38±1.92、8.25±1.67、31.5±2.45。將實驗組分別與正常對照組和模型組進行統計學比較,P<0.01,可以看出實驗組與模型組的陽性凋亡細胞數值的差異有顯著性,具有統計學意義;bcl-2單克隆抗體在正常對照組偶有表達,實驗組呈強陽性表達,模型組較實驗組表達明顯減少(圖2:A為模型組、B為實驗組,見封3)。實驗組、正常對照組和模型組的陽性細胞凋亡數分別為41.88±2.03、21.5±2.07、13.25±2.05。將實驗組分別與正常對照組和模型組進行統計學比較,P<0.01。因此,實驗組和模型組的陽性細胞表達數量的差異具有顯著性,并具有統計學意義。3hgf對廢用性肌凋亡的調節(jié)作用肢體制動是骨關節(jié)病損的一種主要治療手段,由此帶來的骨骼肌廢用性萎縮嚴重的影響了疾病的治療和功能的恢復,在某些情況下其危害性甚至超過了原發(fā)病。如何迅速地緩解肌肉萎縮,恢復運動能力,有著重要的理論和實踐意義。近年來人們在對骨骼肌的萎縮與細胞凋亡之間關系的研究中,發(fā)現細胞凋亡可能在骨骼肌萎縮過程中起著重要的表達作用。Tews指出,隨著制動時間的延長,凋亡的骨骼肌細胞數顯著增加,即使解除制動,要想完全康復到原有水平也極為困難。與凋亡有關的基因有bcl-2基因家族、Ced基因/ICE等基因家族,其中Bc1-2基因位于線粒體膜或核膜及溶酶體膜,其作用是抑制多種原因引起的細胞凋亡。Bcl-2的高表達有助于維持肌細胞的存活,持續(xù)增加的Bc1-2高表達可對抗Bax促進凋亡的作用,而且Bc1-2還可作為反映骨骼肌萎縮預后的重要標記物。本實驗的主要目的是觀察HGF在廢用性肌萎縮預防與治療中的作用,所以我們在制動的當天便開始進行干預治療,而且其在臨床的毒副作用較小,適合臨床長期使用。結果表明,實驗組大鼠骨骼肌中Bcl-2基因的表達明顯高于模型組,而肌細胞凋亡數卻明顯低于模型組,結合電鏡、光鏡所觀察到的骨骼肌超微結構的改變,說明HGF能夠促進骨骼肌的再生,有效的抑制廢用性肌萎縮的發(fā)生。這可能與HGF激活位于細胞外間質的基板膜以及肌纖維漿膜上的衛(wèi)星細胞有關。衛(wèi)星細胞在通常情況下是靜息狀態(tài)的單核干細胞,被激活后會增生,相互融合成多核肌管代替損傷的肌纖維,這一過程伴隨著激活生長因子和酪氨酸蛋白激酶等蛋白酶的釋放,這些生長因子和蛋白酶以不同的方式作用于單核神經細胞、細胞外基質,以及血管再生重塑等過程。在促使血管再生及隨后的肌肉再生分化過程中發(fā)揮重要的作用。而酪氨酸蛋白激酶(PKC)介導的一系列復雜的生化過程抑制凋亡基因的轉錄表達,誘導或激活凋亡抑制基因的表達,如Bc1-2基因等的表達,從而抑制了細胞的凋亡。HGF對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖周期進行調控的特性,給我們在廢用性肌