第七章++基因治療

第七章基因治療湖南師范大學生命科學學院袁婺洲本章目錄7.1基因治療的概念與發(fā)展7.1.1基因治療的概念與策略7.1.2基因治療的基本程序7.1.3基因治療的現(xiàn)狀與展望7.2基因治療的載體7.2.1病毒載體7.2.2非病毒載體7.2.3載體與基因治療中的靶向性問題7.3重要疾病的基因治療7.3.1遺傳病的基因治療7.3.2腫瘤的基因治療7.3.3病毒病的基因治療

第一節(jié)基因治療的概念與發(fā)展

基因治療的概念與策略基因治療的基本程序基因治療的現(xiàn)狀與展望一、

基因治療的概念

基因治療（genetherapy）——就是向有功能缺陷的細胞補充相應功能基因，以糾正或補償其基因缺陷，從而達到治療的目的。NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples基因治療的前提條件

發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達的組織可在體外進行遺傳操作基因治療的策略

1）基因置換，就是用正常的基因原位替換病變細胞內(nèi)的致病基因，使細胞內(nèi)的DNA完全恢復正常狀態(tài)。2）基因修復，是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。3）基因修飾，又稱基因增補。是將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，目的基因的表達產(chǎn)物能夠修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得到加強。4）基因失活，利用反義RNA、核酶或肽核酸等反義技術(shù)及RNA干涉等技術(shù)能特異地封閉基因表達的特性，抑制一些有害基因的表達，以達到治療疾病的目的。5）免疫調(diào)節(jié)，這是將抗體、抗原或細胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，改變病人的免疫狀態(tài)，從而達到預防和治療疾病的目的?；蛑委煹膬煞N途徑

1）exvivo法，是將受體細胞在體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)過適當?shù)倪x擇系統(tǒng)，把重組的受體細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，讓外源基因表達以改善患者癥狀。2）invivo法，直接將外源DAN注射到機體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達發(fā)揮治療作用。invivo法比exvivo法更簡單、直接和經(jīng)濟，療效也比較確切，常用的體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移手段有病毒介導，脂質(zhì)體介導和基因直接注射等。二、基因治療的基本程序

基因治療的主要步驟①目的基因的克?、诨蜣D(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立③靶細胞的選擇④基因的導入。1.目的基因的選擇和制備

用于基因治療的基因必須滿足以下條件：1）在體內(nèi)僅有少量表達就可以顯著改善癥狀；2）該基因的過高表達不會對機體造成危害；3）外源基因可有效導入靶細胞4）外源基因能在靶細胞中長期穩(wěn)定存留5）導入基因的方法及載體對宿主細胞安全無害2.靶細胞的選擇

1）生殖細胞基因的轉(zhuǎn)移只能用顯微注射，效率不高，并且只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動物，不適用于人類。所以，這種靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質(zhì)性進展。2）體細胞采取基因置換、基因修復等方式，但還不能實現(xiàn)特定位點的基因轉(zhuǎn)移。只能采取基因在基因組上非特定定位，隨機整合的方式。只要基因能表達產(chǎn)物就可以達到治療的目的。是一種異?；蚬δ苎a償?shù)幕蛑委煼绞健?/p>

靶細胞的選擇

最好為組織特異性細胞細胞較易獲得，且生命周期較長離體細胞較易受外源基因轉(zhuǎn)化離體細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)，仍較易成活常用的靶細胞造血細胞皮膚成纖維細胞肝細胞血管內(nèi)皮細胞淋巴細胞肌肉細胞腫瘤細胞3.轉(zhuǎn)移載體的選擇與細胞轉(zhuǎn)染病毒感染、顯微注射、電穿孔、化學轉(zhuǎn)染試劑等。4.外源基因的表達及檢測第二節(jié)基因治療的載體

病毒載體非病毒載體載體與基因治療中的靶向性問題一、病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體(AV)腺伴隨病毒載體（AAV）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

retrovirus5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)gagpolenv病毒核心逆轉(zhuǎn)錄酶外殼蛋白抗原基因基因基因逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建(缺陷型病毒)5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)外源目的基因逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建(缺陷型病毒)逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝RNAψ-HelpervirusPackagingcellRNAPackagingproteinVirusRecombinantvirusψ+逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)缺點

優(yōu)點能高效轉(zhuǎn)染宿主細胞，轉(zhuǎn)染率可達100％宿主范圍廣泛可轉(zhuǎn)染大量細胞并長期停留，病毒基因和所載的外源基因都能表達

缺點病毒容量有限(7kb)隨機插入有致癌作用2.腺病毒載體(AV)

腺病毒的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)外殼包囊外殼蛋白：由纖維狀蛋白分子和角蛋白組成骨架蛋白：起著保持包囊形狀的作用DNA結(jié)合蛋白：與DNA結(jié)合線性雙鏈雙螺旋病毒DNAAdenovirus36kbDoubleStrandedDNAGenomeEntrythroughCARreceptorandintegrinco-receptor腺病毒基因組DNA基因組長36kb，兩端各有一個ITR，ITR內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號。6個早期轉(zhuǎn)錄基因：E1a,E1b，E2a,E2b，E3,E4，承擔基因調(diào)控功能1個晚期轉(zhuǎn)錄單元(5個晚期基因L1-L5)：負責結(jié)構(gòu)蛋白的編碼。E1的缺失可能造成病毒再復制階段的流產(chǎn)，E3為復制非必須區(qū)，可被外源基因替代。基因組DNA長36kb，兩端各有一個ITR，ITR內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號。ITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5ITR是反向重復序列E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復制及晚期基因的,表達調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子

L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。腺病毒載體的構(gòu)建第一代腺病毒載體缺少E1a和E1b基因，取代的是治療基因。包裝細胞基因組含有E1基因；但第一代腺病毒載體產(chǎn)生炎癥，而且基因表達快速衰退；第二代腺病毒載體在刪除E1的基礎(chǔ)上，或者突變E2區(qū)或直接除掉E2或E4區(qū)，基因型為E1－\E2－或E1－\E4－。由于保留有E3區(qū)，可抑制宿主的免疫反應。第三代腺病毒載體正在開發(fā)，目的是盡可能多刪除全部的反式序列基因，以降低病毒基因的表達，但腺病毒載體的生產(chǎn)及治療基因在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性可能有影響。腺病毒載體的包裝E1E3DNAE3Cell293腺病毒的包裝Cell293DNAE3腺病毒的優(yōu)缺點

優(yōu)點插入DNA片段較長宿主范圍廣，不需要正在分裂的細胞不整合，減少插入突變的潛在危險

缺點需反復給藥具有免疫原性腺病毒(adenovirus)載體的優(yōu)點復制缺陷型病毒可感染分裂和非分裂細胞病毒顆粒穩(wěn)定，易于濃縮和純化可導入多種靶細胞，并持續(xù)表達無致癌性GelsingerCaseJesseGelsinger:18yr-oldfromArizona,diedon9/17/1999,4dayaftergenetransfer.他患有鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶不足癥（OTCD）

接受3.8×1013腺病毒載體，1％到達靶器官肝臟3.腺伴隨病毒載體（AAV）

腺伴隨病毒屬于細小病毒科，病毒顆粒直徑為20nm，無包膜，20面體。是一類單鏈線狀DNA病毒。AAV感染率很高，而且尚無發(fā)現(xiàn)AAV引起人體疾病的報道，相反，AAV感染者減少了患癌的機會。

腺伴隨病毒載體的基因組AAV基因組很小，兩端也是ITR，中間含有3個啟動子和2個編碼基因（rep和cap）。REP參與病毒復制、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，并與基因組的整合有關(guān)。而CAP是病毒衣殼蛋白。AAV是一種缺陷病毒，只有在與腺病毒等輔助病毒共轉(zhuǎn)染時才能進行有效復制和產(chǎn)生溶細胞感染。在人體，AAV特異整合到19號染色體上，是唯一一種以位點特異性方式整合的真核病毒，從而避免了隨機整合而導致宿主細胞突變的潛在危險性。AAV載體是缺失病毒結(jié)構(gòu)基因，僅保留兩個ITR。使用AAV載體安全，但缺乏高效的包裝細胞。

腺伴隨病毒載體構(gòu)建二非病毒載體

1.裸露DNA2.脂質(zhì)體法1.裸露DNA

直接注射溶液類型對基因表達有影響：重組DNA可貯存于5%~30%的蔗糖溶液中也可用生理鹽水或PBS直接注射法裸露DNA的轉(zhuǎn)移方法電穿孔法微粒子轟擊法2.

脂質(zhì)體法人造單層膜，是一種脂質(zhì)雙層包圍水溶液的脂質(zhì)微球.結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細胞膜極為相似，二者易于融合，DNA由于細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。Liposomes

優(yōu)點穩(wěn)定可攜帶大片段外源DNA可選擇特異的靶細胞無免疫原性

缺點轉(zhuǎn)染效率較低瞬時表達血清抑制脂質(zhì)體的優(yōu)缺點GeneTherapy:DeliveryVehicle第三節(jié)重要疾病的基因治療

遺傳病的基因治療腫瘤的基因治療病毒病的基因治療一、遺傳病的基因治療血友病Bβ地貧囊性纖維化腺苷脫氨酶缺乏癥1.血友病B凝血因子IX缺乏引起，不能正常凝血薛京倫(復旦大學)1991,腺病毒皮膚成纖維細胞FactorIX:提高5%2003,rAAV2-hF.IXβ地貧是由于β珠蛋白基因突變或缺失造成，β珠蛋白肽鏈合成減少，引起患者溶血性貧血。2.β地貧β地貧的基因治療基因轉(zhuǎn)移的治療

向患者的造血干細胞導入正常的β珠蛋白基因反義核酸修復

通過反義核酸與目標mRNA特異性雜交，導致異常表達的mRNA降解，或修飾mRNA的剪接或阻礙的翻譯。cftr基因突變引起正常的CFTR引導氯離子穿過細胞膜患者肺細胞分泌過量的黏液，呼吸困難Achildwithcysticfibrosis3.囊性纖維化（CF）CysticFibrosis:FindingtheGene囊性纖維化的治療壓縮DNA技術(shù)直接將正常DNA導入細胞，補償患者缺乏的CFTR蛋白4.嚴重免疫缺陷癥(SCID)1990.9.14首例基因治療4歲女孩嚴重免疫缺陷癥(SCID)缺乏腺苷酸脫氨酶(ADA)2--脫氧腺苷含量升高毒性嚴重破壞免疫功能AshantideSilva嚴重免疫缺陷癥(SCID)的治療FrenchAnderson(NIH)LTRADASV40neoLTRSeptember14,1990Retrovirus(Mo-MLV)ADA基因LN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶細胞為病人淋巴細胞回輸Adenosinedeaminase二腫瘤的基因治療1.針對抑癌基因治療腫瘤患者50％是由于抑癌基因突變導致將正常的抑癌基因?qū)肽[瘤細胞中，以補償和代替突變或卻失的抑癌基因。

p53,p16,2.針對癌基因治療癌基因是指基因組