空氣懸浮法制備長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊的研究

空氣懸浮法制備長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊的研究

目前，許多微生態(tài)活動(dòng)器都存在兩個(gè)問(wèn)題：一是服用經(jīng)過(guò)加工的活動(dòng)器，其活性物質(zhì)不耐胃酸、膽褐色素和消化酶，因此很容易失去活力。雙螺線菌和其他厭氧菌容易受到外部環(huán)境因素（如氧氣和溫度）的影響，耐低溫，需要在低溫下儲(chǔ)存和銷售，這使得這些產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售和應(yīng)用變差。目前微膠囊技術(shù)是保護(hù)菌體活力最有效和實(shí)用的方法,該技術(shù)是利用天然或合成的高分子材料,將固體、液體甚至是氣體的微小顆粒包裹在直徑從小于1μm至5000μm的半透性或密封囊膜的微型膠囊內(nèi)。由于微膠囊內(nèi)的物質(zhì)與外界隔離,可免受外界不利環(huán)境的影響,若采用腸溶性囊材,還可避免口服時(shí)胃液的破壞?？諝鈶腋》?又稱流化床法)制備微膠囊,是將固體囊心物懸浮于由流化床產(chǎn)生的承載氣流中,呈沸騰狀。囊液由噴嘴噴出,霧化形成微液滴,在囊室與懸浮的囊心物相遇,液滴在囊心物表面鋪展并相互結(jié)合。由于氣體的不斷流動(dòng),溶解囊材的有機(jī)溶劑迅速揮發(fā),聚合物在囊心物表面形成囊衣。被包囊的顆粒隨氣流在囊室循環(huán),完成包囊與固化過(guò)程。本研究將空氣懸浮微膠囊技術(shù)應(yīng)用于微生態(tài)制劑,將長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、保護(hù)劑和雙歧因子包封于腸溶囊膜內(nèi),制成長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌制劑,以期提高口服時(shí)的菌體存活率和常溫下的保存期。1材料表面1.1菌株的覆蓋和保藏中心長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifitdobacteriumlongum,簡(jiǎn)稱BL,CICC6068)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,簡(jiǎn)稱LA,CICC6005):購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。1.2cacl2-meso4的制備長(zhǎng)雙歧桿菌:大豆蛋白胨0.5g,胰蛋白胨0.5g,酵母粉1.0g,葡萄糖1.0g,低聚木糖0.5g,無(wú)機(jī)鹽溶液4mL,蒸餾水100mL,鹽酸半胱氨酸0.05g(培養(yǎng)基熱沸后加入),調(diào)pH7.0,121℃滅菌15min。固體斜面加瓊脂1.5～2.0g。上述無(wú)機(jī)鹽溶液:CaCl20.2g,MgSO4·7H2O0.48g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,NaHCO310g,NaCl2g?；旌螩aCl2和MgSO4在300mL蒸餾水中溶解,加蒸餾水500mL,邊攪拌邊緩慢加入其它鹽類至溶解,加蒸餾水200mL混勻。嗜酸乳桿菌:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g,檸檬酸氫二銨2g,葡萄糖20g,吐溫801mL,CH3COONa·3H2O5g,K2HPO4·3H2O2g,MgSO4·7H2O0.58g,MnSO4·H2O0.25g,蒸餾水1000mL,調(diào)pH6.2～6.4,121℃滅菌15min。固體斜面加瓊脂15～18g。1.3脫脂乳粉m海藻糖:純度>99%(日本林原商事);透明質(zhì)酸(HA):Mr=2.0×106,批號(hào)20040516(山東福瑞達(dá)生物化工);脫脂乳粉(黑龍江完達(dá)山乳業(yè));聚丙烯酸樹脂Ⅱ(泰安明天化工)。1.4干機(jī)、濕機(jī)、水熱機(jī)YQX-II厭氧培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械公司);FreeZone6L冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司);CR20B2高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司);流化床包衣機(jī)(沈陽(yáng)藥科大學(xué)提供);SPX-150恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);S-520掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。2方法2.1保護(hù)劑的配制長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌菌種分別活化,接種,37℃培養(yǎng)20h,于4℃、5000r/min離心10min收集菌體,濕菌體與保護(hù)劑和雙歧桿菌增生促進(jìn)劑低聚木糖溶液混和均勻,得菌懸液,冷凍干燥得凍干菌粉。凍干菌粉磨碎、篩分,將長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌2種菌粉等量混合,備用。保護(hù)劑的配方及其與菌泥的比例為:10%海藻糖、0.6%HA和20%脫脂乳粉(長(zhǎng)雙歧桿菌)或10%海藻糖、0.2%HA和10%脫脂奶粉(嗜酸乳桿菌)分別以1:1:1的體積比復(fù)配后,再與菌泥以3:1的比例混合。低聚木糖的最后濃度為0.5%,無(wú)保護(hù)劑組用磷酸鹽緩沖液代替保護(hù)劑。2.2減少感染計(jì)數(shù)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于固體培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù),37℃厭氧培養(yǎng)20h后菌落計(jì)數(shù)。2.3樣品袋的制備稱取適量聚丙烯酸樹脂Ⅱ,緩慢加入不斷攪拌的95%乙醇溶液中,避免結(jié)塊,繼續(xù)攪拌至完全溶解,加入適量輔料,混勻備用。2.4空氣流量調(diào)節(jié)稱取一次處理量的菌粉置于流化床上,調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)目諝饬髁?使菌粉呈沸騰狀;調(diào)節(jié)溫度、流速和霧化壓力,使囊液呈細(xì)小的液滴噴出。噴出的囊液與呈沸騰狀的菌粉相遇,制得微膠囊。2.5總ph及胰酶液制備人工胃液:取稀鹽酸16.4mL,加水約800mL及胃蛋白酶10g,攪勻后加水定容至1000mL即得。人工腸液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水500mL。用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8;另取胰酶10g,加水適量使溶解。將兩液混合后,加水定容至1000mL即得。人工胃液和人工腸液均采用0.2μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌。2.6不同轉(zhuǎn)速時(shí)相同轉(zhuǎn)速的透光率測(cè)定取微膠囊1g,置于盛有50mL人工胃液(pH1.2)的三角瓶中,再置于(37±0.5)℃恒溫、轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上,分別于0,20,40,60,80,100,120min時(shí)取樣,測(cè)定其在600nm的透光率。另將經(jīng)上述處理的微膠囊離心取沉淀,用人工腸液解囊,適當(dāng)稀釋后活菌計(jì)數(shù),根據(jù)透光率和微膠囊內(nèi)活菌數(shù)變化分析人工胃液中微膠囊的溶出情況。2.7搖床透光率測(cè)定取微膠囊1g,置于盛有50mL人工腸液(pH6.8)的三角瓶中,再置于(37±0.5)℃恒溫、轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上,分別于0,10,20,30,40,50min時(shí)取樣,測(cè)定其在600nm的透光率。另將經(jīng)上述處理的微膠囊,適當(dāng)稀釋后活菌計(jì)數(shù),根據(jù)透光率和微膠囊內(nèi)活菌數(shù)變化分析人工腸液中微膠囊的崩解情況。2.8試驗(yàn)因素及指標(biāo)分析以微囊增重、增塑劑鄰苯二甲酸二乙酯(di-ethylphthalate,DEP)用量和潤(rùn)滑劑硬酯酸鎂用量為試驗(yàn)因素,以微膠囊在人工腸液中的崩解時(shí)間為主要指標(biāo),以微膠囊耐酸性(以在人工胃液中處理2h后菌存活率表示)為參考指標(biāo)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。2.9微膠囊中的活菌數(shù)測(cè)定產(chǎn)品中活菌數(shù)的測(cè)定:取微膠囊1g左右,置于50mL人工腸液中,按2.7所述方法處理45min,適當(dāng)稀釋后活菌計(jì)數(shù)。加入的活菌數(shù)測(cè)定:根據(jù)微膠囊較菌粉增重計(jì)算,取與1g微膠囊相當(dāng)?shù)木?適當(dāng)稀釋后活菌計(jì)數(shù)。微膠囊中的活菌數(shù)=產(chǎn)品中的活菌數(shù)-微膠囊表面的活菌數(shù)微膠囊表面的活菌數(shù)測(cè)定:取微膠囊1g左右,置于50mL、pH5.0的磷酸鹽緩沖液中,按2.6所述方法處理45min,適當(dāng)稀釋后活菌計(jì)數(shù)。包囊產(chǎn)率=微膠囊中的活菌數(shù)/加入的活菌數(shù)×100%包囊效率=微膠囊中的活菌數(shù)/產(chǎn)品中的活菌數(shù)×100%2.10干燥器穩(wěn)定性測(cè)定樣品裝在無(wú)菌敞口小瓶?jī)?nèi),小瓶置于干燥器中,用飽和亞硝酸鈉溶液調(diào)節(jié)干燥器內(nèi)相對(duì)濕度為60%～65%,干燥器于37℃恒溫培養(yǎng)箱中貯存3個(gè)月,每月測(cè)定剩余活菌數(shù),同時(shí)以凍干菌粉作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。3結(jié)果與分析3.1溫度對(duì)膜結(jié)構(gòu)的影響影響空氣懸浮微膠囊化效果的因素主要有:霧化壓力、噴液速度、空氣流量、進(jìn)風(fēng)溫度和物料處理量等。包衣時(shí)噴霧液滴的直徑應(yīng)小于被包囊心,噴霧液滴的大小是噴液速度和霧化壓力綜合作用的結(jié)果。在恒定的霧化壓力下,加大噴液速度使液滴變大;在恒定的噴液速度下,加大霧化壓力液滴變小。不論何種原因引起的液滴粒徑變大都會(huì)增加粒子粘連的趨勢(shì)。包衣前首先要進(jìn)行噴霧測(cè)試,檢查噴霧狀態(tài)是否連續(xù)均勻。包囊微粒時(shí),因包衣增重大,在不發(fā)生粘連的前提下,應(yīng)盡量加大噴液速度,以縮短包衣時(shí)間。溫度對(duì)膜結(jié)構(gòu)的影響與成膜材料、溶劑、增塑劑種類及包囊物的理化性質(zhì)有關(guān)。進(jìn)風(fēng)溫度的選擇是以有機(jī)溶劑盡快揮發(fā)又不至于使菌體失活為原則。一般用有機(jī)溶劑的囊液操作溫度應(yīng)低于水分散體的系統(tǒng)。溫度過(guò)高造成菌體失活,且衣膜干燥過(guò)速,易產(chǎn)生氣泡,表面粗糙;溫度過(guò)低,溶劑蒸發(fā)太慢,會(huì)引起包囊物粘結(jié)。空氣流量的大小決定物料通過(guò)包衣區(qū)的速度和物料的流化狀態(tài),因而該參數(shù)影響干燥效率和包衣均勻性。若氣流太高,會(huì)使菌粉流化時(shí)劇烈沸騰,不利于囊心物與囊液液滴充分地接觸;氣流過(guò)低,菌粉不能達(dá)到沸騰狀態(tài),使循環(huán)包衣失敗。要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定合適的空氣流量,既防止物料過(guò)多地吸附于柱筒壁上,又保證物料充分流化。物料處理量是保證微囊化時(shí)批次間重現(xiàn)性的重要參數(shù)。當(dāng)物料量增加時(shí),為達(dá)到理想的流化效果,需要增加進(jìn)風(fēng)量,同時(shí)噴液速度及霧化壓力都要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整,即物料處理量與其它微囊化操作條件是相對(duì)應(yīng)的。因此為得到穩(wěn)定的產(chǎn)品,每次的物料處理量應(yīng)一致。綜合考慮上述因素,經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn),確定流化床微膠囊化操作條件為:霧化壓力0.2MPa;空氣流量10～12m3/min;流化床進(jìn)氣溫度35～45℃;囊液流速1mL/min;物料處理量5～10g。3.2混懸液成膜效果囊液濃度對(duì)噴霧性能產(chǎn)生重要影響。以95%乙醇為溶劑,比較6%,8%,10%3種濃度的聚丙烯酸樹脂Ⅱ,發(fā)現(xiàn)6%囊液黏度小,噴射時(shí)呈霧區(qū)高,單位體積囊材少,溶劑蒸發(fā)較慢;10%囊液黏度過(guò)大,不容易被分散,液滴大且易阻塞噴嘴,增大氣流量時(shí)破壞囊心物的流化;而8%囊液黏度適中,成膜效果好,溶劑蒸發(fā)速度適當(dāng),粘結(jié)現(xiàn)象少。因此本研究所用囊液為以95%乙醇為溶劑的8%聚丙烯酸樹脂Ⅱ。3.3增塑劑和潤(rùn)滑的用量制備微膠囊時(shí),囊液的用量與囊心物的表面積有密切的關(guān)系。囊心物越細(xì)小,其比表面積越大,則囊材用量也越大。由于本研究采用的囊心物為凍干菌粉,形狀不規(guī)則,無(wú)法將其近似為球體來(lái)計(jì)算表面積,故可由最后產(chǎn)品增重來(lái)確定囊液的用量。高聚物作為囊材,單獨(dú)應(yīng)用形成的薄膜在溫度降低后,物理性質(zhì)發(fā)生變化,囊膜變得硬而脆,容易破裂。為改進(jìn)囊膜質(zhì)量,常在囊液處方中添加增塑劑。潤(rùn)滑劑的作用是有助于粒子充分流化,減少粒子間粘連。增塑劑和潤(rùn)滑劑的用量通過(guò)正交試驗(yàn)確定,結(jié)果如表2、3。正交試驗(yàn)3個(gè)因素對(duì)微膠囊在人工腸液中崩解性的影響順序是:微囊增重>硬酯酸鎂用量>DEP用量,最佳組合為:A1B1C3或A2B1C3。根據(jù)菌體在人工胃液中的存活率,最終選擇A2B1C3,即微膠囊較菌粉增重20%,DEP用量10%,硬酯酸鎂用量1.5%。3.4菌粉和微膠囊的活菌數(shù)及存活率將凍干菌粉和微膠囊分別置于人工胃液中處理,于2h后取樣,用無(wú)菌水將膠囊顆粒清洗2次,再放入人工腸液中進(jìn)行崩解,測(cè)經(jīng)人工胃液處理2h后囊中的活菌數(shù)。菌粉和微膠囊中的活菌數(shù)及存活率比較見表4。微囊化菌粉在人工胃液中處理2h后,存活率達(dá)到54.08%,而凍干粉的存活率僅為十萬(wàn)分之一,表明直接服用凍干菌粉不能保證足夠量的活菌進(jìn)入腸道,制備成腸溶性微膠囊后,其耐酸性顯著提高。微膠囊經(jīng)人工胃液處理40min后,發(fā)生渾濁,透光率降低,表明有部分微膠囊因包囊不完全而發(fā)生滲漏,見圖1。40min后繼續(xù)處理至2h,透光率基本穩(wěn)定,表明微膠囊在人工胃液中基本不發(fā)生泄漏,耐酸性良好。3.5不同濃度人工腸液微膠囊的變化見表5。微膠囊在人工腸液中逐漸溶解,處理至30min時(shí),透光率降至最低值,且人工腸液中未見固體顆粒,30min后透光率和釋放率基本穩(wěn)定,表明微膠囊已完全崩解,見圖2。由此判斷,該法制備的微膠囊具有良好的腸溶性。3.6收菌數(shù)的確定測(cè)得微膠囊產(chǎn)品中的活菌數(shù)為9.56×109CFU/g,微膠囊表面的活菌數(shù)為1.2×109CFU/g,則微膠囊中的活菌數(shù)=9.56×109–1.2×109=8.36×109(CFU/g)。根據(jù)微膠囊較菌粉增重20%計(jì)算,每1g微囊含菌粉0.83g,因此加入的活菌數(shù)為1.48×1010CFU/g微囊。包囊產(chǎn)率=8.36×109/1.48×1010=56.49%,包囊效率=8.36×109/9.56×109=87.45%。3.7加保護(hù)劑對(duì)菌粉微囊化的影響將添加保護(hù)劑與未加保護(hù)劑的凍干菌粉分別制成微膠囊,再與凍干菌粉進(jìn)行比較,活菌變化結(jié)果如表6。微膠囊和菌粉在恒溫37℃、相對(duì)濕度60%～65%條件下貯存3個(gè)月后,發(fā)現(xiàn)菌粉吸水,粘連成團(tuán),顏色變深;微膠囊形態(tài)、顏色均無(wú)變化。貯存期間活菌數(shù)均逐步降低,菌粉微囊化后存活率顯著提高