第二章 基因工程

第二章基因工程一、緒論1、什么是基因？如何分類(lèi)？什么是基因表達(dá)？2、什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的應(yīng)用前景如何？1、什么是基因？如何分類(lèi)？什么是基因表達(dá)？

基因，在希臘語(yǔ)中是“給予生命”之意，1909年，丹麥生物學(xué)家首先使用名詞“基因”代替“遺傳因子”這個(gè)術(shù)語(yǔ)。1）經(jīng)典的基因概念（Theoryofthegene）1926T.H.Morgan基因是染色體上的實(shí)體基因象鏈珠(bead)一樣，孤立地呈線狀地排列在染色體上基因是(Threeinone)

；功能(functionalunit)突變(mutationunit)

交換(cross-overunit)

“三位一體”的最小的不可分割的基本的遺傳單位(1926T.H.Morgan)1910年始做果蠅雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)“連鎖遺傳規(guī)律”,并概括提出“基因論”1、什么是基因？如何分類(lèi)？什么是基因表達(dá)？

2）后來(lái)順?lè)醋永碚摵筒倏v子理論的提出對(duì)經(jīng)典的基因概念做了重要修正與發(fā)展。順?lè)醋永碚摰闹匾碚摶A(chǔ)：①“一個(gè)基因一個(gè)酶”假說(shuō)1941Beadle&Tatum基因的化學(xué)本質(zhì)就是DNA分子

1944Avery.O.T

順?lè)醋訉W(xué)說(shuō)：一個(gè)順?lè)醋泳褪且粋€(gè)基因，這個(gè)基因或者編碼蛋白質(zhì)，或者編碼RNA分子。在一個(gè)順?lè)醋觾?nèi)，有若干個(gè)突變單位突變子

在一個(gè)順?lè)醋觾?nèi)，有若干個(gè)交換單位交換子順?lè)醋訉W(xué)說(shuō)徹底否定了基因是決定遺傳性狀的功能單位和突變、重組的最小單位這樣三位一體的概念。onegene→onefunction(Ribozyme,Abzyme,rDNA,tDNA..)

onegene→oneenzymeLac.Operon誘導(dǎo)物操縱子理論

(Lactoseoperon1961.Jacob,Monod)

基因功能的表現(xiàn)是若干基因組成的信息表達(dá)的整體行為IPOZYA

zonegene→onepeptideya1、什么是基因？如何分類(lèi)？什么是基因表達(dá)？

3）基因：是一段含有特定遺傳信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性狀的功能和結(jié)構(gòu)單位。1、什么是基因？如何分類(lèi)？什么是基因表達(dá)？

4）從分子水平來(lái)說(shuō)，基因有三個(gè)基本特性。

基因可自體復(fù)制1953年Watson-Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。說(shuō)明了半保留復(fù)制機(jī)制，兩股DNA彼此分開(kāi)，以每一股為模板，按堿基配對(duì)的規(guī)則，各自配上一股新的DNA，復(fù)制便告完成?；虻囊话闾攸c(diǎn)

基因決定性狀

生物體的表（現(xiàn)）型（phenotype）是指有機(jī)體可見(jiàn)的或可計(jì)算的外在性質(zhì)，而基因型（genotype）是指控制這些表型的遺傳因子?；虻囊话闾攸c(diǎn)

基因突變

基因通常是一個(gè)穩(wěn)定的遺傳單位，但它也可能發(fā)生可遺傳的變異，這種變異叫基因突變（mutation）。突變以后的基因以新的形式穩(wěn)定遺傳。攜帶突變基因的生物體叫突變體（mutant），攜帶正?；虻纳矬w叫野生型（wildtype)?；虻囊话闾攸c(diǎn)5）、根據(jù)是否轉(zhuǎn)錄和翻譯功能可分三類(lèi)：一類(lèi)是既有轉(zhuǎn)錄功能又有翻譯功能的基因，這類(lèi)基因是指編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因及編碼阻遏蛋白的調(diào)節(jié)基因（統(tǒng)稱(chēng)為蛋白質(zhì)基因）；第二類(lèi)是只有轉(zhuǎn)錄功能而沒(méi)有翻譯功能的基因，包括編碼tRNA和rRNA的基因；第三類(lèi)是既不轉(zhuǎn)錄也不翻譯的基因，包括啟動(dòng)基因、操縱基因、增強(qiáng)子等（有時(shí)也把它稱(chēng)為調(diào)控基因）。6）所以基因表達(dá)不能說(shuō)就是遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯從（DNA）傳遞到蛋白質(zhì)的過(guò)程?；虮磉_(dá)：是基因表現(xiàn)其生物功能所經(jīng)歷的一系列分子轉(zhuǎn)化和相互作用的過(guò)程。2、什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的前景如何？

（1）、基因工程：應(yīng)用DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物的遺傳性狀，創(chuàng)造新生物物種，通過(guò)工程化為人類(lèi)提供有用產(chǎn)品及服務(wù)的技術(shù)。遺傳工程：是包括基因工程在內(nèi)的人工改造生物遺傳性狀的全部技術(shù)；DNA重組技術(shù)：是采用酶法，將不同來(lái)源DNA進(jìn)行體外切割與連接構(gòu)成雜種DNA分子：分子克?。褐饕侵窪NA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程。三者之間有聯(lián)系，但是有不同。（2）產(chǎn)生的背景：一方面是科學(xué)發(fā)展的必然要求（當(dāng)時(shí)育種工作、癌等的治療都要求科技應(yīng)有所突破）；另一方面是有關(guān)基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)理論研究的重大突破和技術(shù)的必然結(jié)果。（3）基因工程的成果和發(fā)展前景A、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生B、基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)C、基因工程與環(huán)境保護(hù)A基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程藥品的生產(chǎn)許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來(lái)源限制產(chǎn)量有限，其價(jià)格往往十分昂貴。微生物生長(zhǎng)迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問(wèn)題，還能大大降低生產(chǎn)成本?；蚬こ桃葝u素（一）胰島素是治療糖尿病的特效藥，長(zhǎng)期以來(lái)只能依靠從豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。胰島素分子結(jié)構(gòu)基因工程胰島素（二）將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問(wèn)題，還使其價(jià)格降低了30%-50%!胰島素生產(chǎn)車(chē)間其它基因工程藥物人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過(guò)基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類(lèi)的病苦，提高人類(lèi)的健康水平發(fā)揮了重大的作用。人造血液及其生產(chǎn)B基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)運(yùn)用基因工程技術(shù)，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性好的農(nóng)作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動(dòng)、植物。轉(zhuǎn)魚(yú)抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯不會(huì)引起過(guò)敏的轉(zhuǎn)基因大豆超級(jí)動(dòng)物導(dǎo)入貯藏蛋白基因的超級(jí)羊和超級(jí)小鼠特殊動(dòng)物導(dǎo)入人基因具特殊用途的豬和小鼠C基因工程與環(huán)境保護(hù)基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測(cè)環(huán)境中的病毒、細(xì)菌等污染。1t水中只有10個(gè)病毒也能被DNA探針檢測(cè)出來(lái)基因工程在環(huán)境監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用基因工程與環(huán)境污染治理基因工程做成的“超級(jí)細(xì)菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)。通常一種細(xì)菌只能分解石油中的一種烴類(lèi)，用基因工程培育成功的“超級(jí)細(xì)菌”卻能分解石油中的多種烴類(lèi)化合物。有的還能吞食轉(zhuǎn)化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質(zhì)。A重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ)二基因工程的基本原理19世紀(jì)中孟德?tīng)?/p>

豌豆雜交試驗(yàn)

遺傳因子

經(jīng)典遺傳學(xué)20世紀(jì)初摩爾根

果蠅雜交實(shí)驗(yàn)

基因

基因?qū)W1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

遺傳物質(zhì)DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學(xué)1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

分子生物學(xué)基因工程B基因的分子生物學(xué)二基因工程的基本原理C基因工程的基本原理提高外源基因的劑量——分子遺傳學(xué)原理篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：?jiǎn)?dòng)子、

增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學(xué)原理

修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理

——分子生物學(xué)原理

D基因工程的支撐技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)三基因工程的基本條件C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶A用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶類(lèi)。1、限制酶：凡能識(shí)別和切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶類(lèi)，全稱(chēng)是限制性核酸內(nèi)切酶（1）、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象（R/M體系）因此發(fā)現(xiàn)了兩種酶：核酸內(nèi)切酶：破壞外源DNA，使之迅速降解；

甲基化酶：保護(hù)自身DNA不受限制。

1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII

限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈；主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵（2）限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶根據(jù)屬名和種名相結(jié)合的原則，即取細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母（大寫(xiě)）+種名的前兩個(gè)字母（小寫(xiě)）表示。（若有株名時(shí)，用株名第一個(gè)字母置于三字母后）（3）核酸限制性內(nèi)切酶的類(lèi)型根據(jù)識(shí)別序列和切割位點(diǎn)的一致性，分為3類(lèi)：

其中II型酶的核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用是分開(kāi)的，且具有序列特異性，在基因克隆中廣泛使用。II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)具有很強(qiáng)的底物專(zhuān)一性，其底物只能是雙鏈DNA分子，對(duì)單鏈RNA及雙鏈DNA-RNA雜交分子均不起作用；EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

(4)：影響限制酶活性的因素：底物的純度；純度高則酶活性強(qiáng)DNA的甲基化程度；甲基化程度高則酶活性弱DNA分子結(jié)構(gòu)；環(huán)狀雙螺旋DNA分子較線性DNA穩(wěn)定，所需酶量較線性多。反應(yīng)溫度；

大多數(shù)為37℃，特別：SmaI：25，ApaI：30，MaeI：45反應(yīng)緩沖液。終止限制酶反應(yīng)的方法：加熱失活，65℃保溫5分鐘；如是耐熱酶，則可用脲、SOS、及胍等變性劑使之失活。2、DNA連接酶及T4-DNA連接酶問(wèn)題：什么是連接酶？?jī)煞N連接酶各有什么特點(diǎn)？能催化DNA片段5‘-磷?；c3’-羥基形成磷酸二酯鍵的酶。T4-DNA連接酶是T4-噬菌體編碼的一種重要連接酶特點(diǎn)：DNA連接酶只能封閉缺口，而不能封閉裂口；只能連接粘性末端，不能連接平整末端。T4-DNA連接酶既能連接粘性末端，又能連接平整末端。但用量大。DNA連接酶(ligase):催化2條鏈3’-OH和5’-P之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶的活性能封閉nick，而非gap反應(yīng)溫度：37℃為最佳溫度26℃反應(yīng)4小時(shí)4℃過(guò)夜

nickgap3、DNA聚合酶：將脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I(E.coli.DNAPolI)

特點(diǎn)：5’-3’DNA聚合酶活性：Mg2+、單鏈DNA模板、3’-OH末端3’-5’外切酶活性：識(shí)別消除不配對(duì)堿基5’-3’外切酶活性作用DNA缺口轉(zhuǎn)移（2）大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)特點(diǎn)5’-3’聚合酶3’-5’外切酶應(yīng)用用同位素標(biāo)記DNA片段的末端補(bǔ)平粘末端合成cDNA第二鏈Sanger雙脫氧法進(jìn)行序列測(cè)定定位突變B用于基因克隆的載體

問(wèn)題：什么是載體？做為載體必須符合哪些條件？基因工程為什么要用載體？什么是受體、克隆和重組體（重組子）？載體：能將目的基因運(yùn)載進(jìn)生物細(xì)胞并在其中自我復(fù)制的遺傳因子。

載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體應(yīng)具備的條件在細(xì)胞中能自我復(fù)制，即本身是復(fù)制子(可繁殖性)；具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片斷后，不影響其本身的復(fù)制功能(可利用性)；在基因重組中有1-2個(gè)篩選標(biāo)記從而容易進(jìn)行選擇(具有便利性)；分子小，多拷貝，安全性好，適應(yīng)性強(qiáng)，容易控制，便于表達(dá)。在基因工程中，載體一般是用天然質(zhì)?；虿《緸椴牧?，經(jīng)過(guò)人工改造或重新構(gòu)建而成，改造的目標(biāo)：1、質(zhì)粒改小(增加有效裝載量和拷貝數(shù))2、減少相同的限制酶切點(diǎn)，使載體適合于多種限制性酶的切割3、引入強(qiáng)的復(fù)制原點(diǎn)，構(gòu)建克隆載體4、引入強(qiáng)的啟動(dòng)子和其它表達(dá)序列，構(gòu)建表達(dá)載體。5、引入兩種不同的復(fù)制原點(diǎn)，構(gòu)建穿梭載體。1、質(zhì)粒載體（PlasmidUector）：質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類(lèi)型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱(chēng)為質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群粒的不相容性，不相容性的質(zhì)質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢?lèi)：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、R、Col質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用(用做基因工程的載體更為安全)值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒的分類(lèi)人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類(lèi)：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來(lái)自pSC101拷貝數(shù)小于10表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選PBR322質(zhì)粒：PBR322質(zhì)粒是大腸桿菌質(zhì)粒載體，有萬(wàn)能質(zhì)粒載體之稱(chēng)。它是由PSF2124、PMB8、PSC101三個(gè)親本質(zhì)粒經(jīng)過(guò)復(fù)雜的重組構(gòu)成的。PSF2124—帶有氨芐青霉素抗菌素基因（Ampr）；PMB8—帶有ColEⅠ松馳型復(fù)制子；

PSC101—帶有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（Tetr）。因此PBR322質(zhì)粒是一個(gè)帶有（Ampr）和（Tetr）標(biāo)記的松馳型質(zhì)粒載體。重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：2.6x106道爾頓拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆2、噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類(lèi)非細(xì)胞微生物，能高效高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：溶源狀態(tài)

l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶源狀態(tài)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶源狀態(tài)。DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度

野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類(lèi)：免疫功能類(lèi)標(biāo)記顏色反應(yīng)類(lèi)標(biāo)記大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因受體：用于擴(kuò)增載體及目的基因的細(xì)胞?？寺。耗康幕虻臄U(kuò)增過(guò)程。重組體（重組子）：攜帶重組DNA分子的受體細(xì)胞。對(duì)受體要求：

※對(duì)人體無(wú)害：※繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、從而在短時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)生大量的后代，得到大量的基因拷貝和產(chǎn)物；※限制系統(tǒng)缺陷，對(duì)外來(lái)DNA不降解；

※有蛋白質(zhì)的加工修飾