半閉彎尾姬蜂對小菜蛾幼蟲血細胞噬菌能力的影響

半閉彎尾姬蜂對小菜蛾幼蟲血細胞噬菌能力的影響

吞咽活動是由信號觸發(fā)的一系列緊密的細胞活動。這是細胞最重要的功能之一（strand，2008）。單細胞生物通過吞噬攝取外界的營養(yǎng)物質(zhì),而多細胞生物則通過吞噬作用參與胚胎發(fā)育過程和體內(nèi)針對病原物的免疫過程(LavineandStrand,2002)。對昆蟲而言,血細胞的吞噬作用更是免疫系統(tǒng)的重要組成部分(Hoffmann,1995;Strand,2008)。在吞噬過程中,首先是功能細胞表面受體識別外源異物并將此信號向胞內(nèi)傳遞,引起胞膜的活化,使細胞骨架發(fā)生重構(gòu),細胞以偽足伸出的形式進行延展從而執(zhí)行吞噬(deWinteretal.,2007)。在寄主-寄生蜂系統(tǒng)中,寄主血細胞吞噬功能的變化被認為是寄生蜂調(diào)控寄主免疫生理的主要手段之一(LiandWebb,1994;Strandetal.,2006)。毒液是寄生蜂影響及調(diào)控寄主生理的基本因子之一,能夠與其他寄生因子,如多分DNA病毒(polydnavirus,PDV)等一起在寄生時進入寄主體內(nèi)。毒液能夠單獨或在其他寄生因子的協(xié)助下麻痹寄主、影響寄主生長發(fā)育或者破壞寄主免疫系統(tǒng)(BeckageandGelman,2004)。不同寄生蜂體內(nèi)毒液的成分及功能不同,這與寄生蜂本身所處的系統(tǒng)地位、寄生習(xí)性和寄主范圍等相關(guān)(MoreauandGuillot,2005)。迄今為止,有關(guān)于寄生蜂毒液的研究大多集中于外寄生蜂,其功能主要是導(dǎo)致寄主麻痹或死亡,從而方便幼蜂攝取寄主營養(yǎng)以完成個體發(fā)育(Weaveretal.,2001)。有關(guān)于內(nèi)寄生蜂毒液的研究,特別是毒液作為獨立因子調(diào)控寄主生理的研究相對較少且零散(Asgari,2006)。目前,大部分研究認為具有PDV的內(nèi)寄生蜂在調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的過程中,起主要作用的是PDV而不是毒液(Beckage,1998;Asgari,2006)。內(nèi)寄生蜂毒液的功能主要是協(xié)助PDV或其他寄生因子對寄主的生理進行調(diào)控(MoreauandGulliot,2005),如毀側(cè)溝繭蜂Microplitisdemolitor的毒液單獨不能對其寄主造成任何影響,但是卻能對PDV起到增效作用(StrandandDover,1991)。然而,也有研究表明,內(nèi)寄生蜂的毒液具有一定的單獨行使功能的能力,如高濃度的菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis毒液能夠在短時間內(nèi)抑制寄主小菜蛾幼蟲血細胞的延展能力(Yuetal.,2007)。事實上,內(nèi)寄生蜂毒液在內(nèi)寄生蜂調(diào)控寄主的過程中發(fā)揮了眾多作用(表1)(Asgari,2006)。半閉彎尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen是小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaL.的優(yōu)勢內(nèi)寄生蜂(Waterhouse,1992),擁有PDV和毒液等寄生因子(Huangetal.,2008b),能夠?qū)闹餍〔硕甑臓I養(yǎng)生理和免疫系統(tǒng)進行有效的調(diào)控(Huangetal.,2008a,2009)。但是關(guān)于半閉彎尾姬蜂毒液的功能卻鮮有報道。目前已有研究表明,半閉彎尾姬蜂寄生能夠減少被寄生小菜蛾幼蟲體內(nèi)的血細胞數(shù)量,細胞的延展和包囊作用也暫時受到抑制,但經(jīng)過一段時間后可恢復(fù)(Huangetal.,2009)。但并無研究內(nèi)容涉及血細胞吞噬功能的變化,也不涉及單獨寄生因子對此過程的調(diào)控研究。本文在此基礎(chǔ)上,就半閉彎尾姬蜂毒液對寄主血細胞的延展行為及吞噬作用的影響展開研究,期望可以進一步明確半閉彎尾姬蜂調(diào)控寄主小菜蛾血細胞免疫的生理機制。1材料和方法1.1幼蟲放養(yǎng)及寄生蟲小菜蛾在控光(14L∶10D,光照強度>1000lx)、控溫(22±1℃)、控濕(相對濕度60%～80%)的養(yǎng)蟲室或智能人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。按李廣宏等(1995)的方法,以20%的蜂蜜水飼養(yǎng)成蛾,盆栽甘藍飼養(yǎng)幼蟲。半閉彎尾姬蜂采自鄭州郊區(qū),在控光、溫、濕的人工氣候室內(nèi),參照陳宗麒等(2003)方法進行繁殖及續(xù)代,成蜂供給10%的蜂蜜水。小菜蛾2齡幼蟲大小及生理狀態(tài)具有高度的一致性,因此為保證實驗中處理與對照的可比性,試蟲均采用剛進入3齡的幼蟲,即先挑取2齡末幼蟲,待其蛻皮后用于寄生。采用“單頭單管寄生”的方法寄生供試的小菜蛾幼蟲,具體操作如下:在一支長8cm、直徑1.5cm的小試管內(nèi)引入羽化2d已交配過的雌蜂1頭,然后用毛筆挑取小菜蛾幼蟲1頭放入管內(nèi),觀察產(chǎn)卵行為發(fā)生一次后用毛筆移出幼蟲,換另1頭未寄生的幼蟲重復(fù)操作。將寄生過的小菜蛾幼蟲接到事先準備好的葉片或盆菜上飼養(yǎng),用于實驗。1.2幼蟲的消毒處理小菜蛾幼蟲在-20℃冷凍麻痹,依次用75%的酒精和PBS(pH7.4)清洗體表并在濾紙上擦干后,在Parafilm膜上用滅菌后眼科剪剪去幼蟲的腹足,待血淋巴自然流出后用無菌毛細管吸取并加入到預(yù)先添加昆蟲血細胞培養(yǎng)基的96孔板中,在25℃下孵育。1.3蛋白毒囊檢測收集半閉彎尾姬蜂雌蜂,活體條件下封凍于-80℃,2周內(nèi)集齊100頭雌蜂然后進行解剖收取毒液。解剖時,解凍雌蜂并依次用75%的酒精、PBS(pH7.4)清洗體表并在濾紙上吸干后,冰上解剖雌蜂,收集毒腺,撕破毒囊,使毒液釋放到20μLPBS中,-80℃貯藏或直接進行實驗。Bradford方法測蛋白毒囊內(nèi)蛋白含量。SDS分析蛋白組分,電泳條件為:12%的分離膠,2.5%濃縮膠,電極緩沖液為Tris-甘氨酸電極緩沖液系統(tǒng);電泳電壓80V。1.4在原代培養(yǎng)的未寄生小菜蛾幼蟲血細胞培養(yǎng)液中加入毒液,使培養(yǎng)液中的毒液濃度分別達到0.01,0.02,0.04,0.06,0.08和0.1當量/μL;每個濃度設(shè)5個重復(fù),分別于1h和4h后置于Leica倒置顯微鏡(LeicaDMIRB)下觀察漿血細胞和顆粒血細胞的延展行為,漿血細胞變?yōu)樗笮位蚱渌灰?guī)則形狀則判為延展,顆粒血細胞以伸出偽足為延展,兩種細胞均以圓形為未延展。1.5外周血輸注后小鼠紅細胞噬菌能力檢測大腸桿菌Escherichiacoli的異硫氰酸熒光素(fluorescein-5-isothiocyanate,FITC)標記方法參考Beck和Strand(2005)。將熱滅活的大腸桿菌放入0.5%含F(xiàn)ITC(0.1mg/mL)的碳酸緩沖液(pH9.5),使其終濃度達到109/mL,置于37℃培養(yǎng)30min后,用磷酸緩沖液清洗菌體直至上清不含F(xiàn)ITC為止,于-20℃貯存。噬菌作用具體試驗步驟如下:100μL細胞培養(yǎng)基中加入苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)(0.02%),加入1頭小菜蛾的血淋巴,25℃培養(yǎng)30min后,加入FITC標記的大腸桿菌,大腸桿菌與血細胞的數(shù)量比在15∶1～30∶1之間;25℃中放置2～3h后在熒光倒置顯微鏡(LeicaDMIRB)下觀察血細胞的噬菌狀況。試驗分2組處理:處理Ⅰ為半閉彎尾姬蜂寄生(即包含毒液和PDVs等的所有寄生因子)對小菜蛾幼蟲血細胞噬菌能力的影響,樣品取自寄生后1h和24h的小菜蛾幼蟲,分別設(shè)5個重復(fù);處理Ⅱ為毒液對血細胞噬菌能力的影響,樣品為未被寄生的小菜蛾幼蟲血淋巴,并在培養(yǎng)液中加入梯度濃度的毒液,分別為0.01,0.02,0.04,0.06,0.08和0.1當量/μL,每個濃度設(shè)5個重復(fù)。2結(jié)果2.1半閉彎尾姬蜂濾液的電泳分析單頭半閉彎尾姬蜂毒液囊中蛋白含量為0.106±0.016μg。通過SDS電泳分析,半閉彎尾姬蜂毒液中大部分蛋白的分子量集中在35～220kDa之間,其中分子量在35～70kDa之間的幾種小分子蛋白的含量相對較高;同時,在電泳圖中也出現(xiàn)了少數(shù)分子量小于15kDa的小肽(圖1)。2.2小菜器紅細胞在培養(yǎng)液中的殘留情況測定,對于小菜紅為了明確毒液的功能,本試驗將正常小菜蛾血細胞提取后進行體外培養(yǎng),同時在培養(yǎng)液中加入不同濃度的毒液。結(jié)果表明,小菜蛾血細胞能夠在含有0.01～0.1當量/μL毒液的培養(yǎng)液中正常延展;且隨著培養(yǎng)時間的延長,血細胞的延展能力不受到影響(圖2)。2.3小菜紅酵母的培養(yǎng)在含有不同濃度(0.04,0.06,0.08和0.1當量/μL)半閉彎尾姬蜂毒液的培養(yǎng)液中進行小菜蛾幼蟲血細胞的培養(yǎng),同時也加入足量的經(jīng)FITC標記的大腸桿菌。結(jié)果顯示,即使培養(yǎng)液中含有較高濃度的半閉彎尾姬蜂毒液,但小菜蛾顆粒血細胞仍然能夠順利地吞噬大量的大腸桿菌(圖3)。2.4小菜器紅細胞的動態(tài)半閉彎尾姬蜂寄生時會將毒液、PDV及萼液蛋白等寄生因子同時注入小菜蛾幼蟲血腔內(nèi)。將寄生后1h的寄主幼蟲血細胞取出后進行體外培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的顆粒血細胞和漿血細胞都不能延展,無法如對照細胞一般伸出明顯的偽足,而呈現(xiàn)圓餅狀(圖4:A)。雖然圖4(A)中的顆粒血細胞無法發(fā)生延展,但是,其細胞膜周圍卻附著著大量的大腸桿菌,然而附著在胞膜表面的大腸桿菌并沒有被進一步吞噬進入細胞內(nèi)(圖4:B)。半閉彎尾姬蜂寄生后24h的小菜蛾幼蟲血細胞能夠正常延展,如圖4(C)所示。從圖中可以看到,漿血細胞伸出明顯長且不規(guī)則的偽足,而顆粒血細胞的偽足則相對較短且密;同時,在發(fā)生延展的顆粒血細胞的胞質(zhì)內(nèi)可以明顯地觀察到發(fā)出熒光的亮點,即經(jīng)過FITC標記的大腸桿菌(圖4:D)。3半閉彎尾姬蜂注射液主要功能蛋白分布毒液是寄生蜂與寄主協(xié)同進化的結(jié)果,在調(diào)節(jié)寄主發(fā)育、保證寄生蜂成功寄生中發(fā)揮著非常重要的作用(Quicke,1997)。研究發(fā)現(xiàn),大部分寄生蜂毒液蛋白分子量都比較大(MoreauandGuillot,2005),如近曲斑甲腹繭蜂Chelonussp.nearcurvimaculatus(LelukandJones,1989)、麥蛾繭蜂Braconhebetor(Quistadetal.,1994)和菜粉蝶絨繭蜂Cotesiaglomeratus(Leluketal.,1989)毒液中的蛋白分子量分別不低于30,20和18kDa。但是也有一些寄生蜂的毒液中存在小分子多肽,如東方旋小蜂Eupelmusorientalis(Douryetal.,1997)、瘤姬蜂Pimplahypochondriaca(Danietal.,2003)、縮基反顎繭蜂Asobaratabida(Moreauetal.,2004)、微紅絨繭蜂Cotesiarubecula(Zhangetal.,2004a)和頸雙緣姬蜂Diadromuscollaris(酈衛(wèi)弟等,2006)等毒液中發(fā)現(xiàn)了分子量小于10～15kDa的多肽。半閉彎尾姬蜂毒液蛋白的分子大小具備寄生蜂毒液的特點,既有大于100kDa的大分子蛋白,也含有個別小于15kDa的小分子蛋白,但大部分蛋白的大小處于35～70kDa之間,這與其他寄生蜂的毒液蛋白的分布比例(按分子量大小)相似,如黃腹?jié)撓壚O蜂Opiuscaricivorae的毒液中20.1～43.5kD的蛋白帶含量最高(萬志偉等,2005),蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum和麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis(Zhangetal.,2005)以及頸雙緣姬蜂D.collaris(酈衛(wèi)弟等,2006)等寄生蜂毒液中含量較高的蛋白也處于近似的范圍內(nèi)。而且,大部分從寄生蜂毒液中分離得到的功能蛋白組分,其分子大小也集中在這個范圍內(nèi)(BeckageandGelman,2004),如黑頭折脈繭蜂Cardiochilesnigriceps毒液中含一種大小為66kDa的蛋白,可延長寄主幼蟲的發(fā)育歷期(TanakaandVinson,1991);微紅絨繭蜂C.rubecula毒液中含有一種為50kDa的蛋白,則可以抑制寄主血淋巴的黑化(Asgarietal.,2003)。通過與其他寄生蜂毒液的蛋白條帶比較,推測半閉彎尾姬蜂毒液也可能含有具備調(diào)控寄主生理作用的功能蛋白。Huang等(2009,2010)研究證明,小菜蛾幼蟲體內(nèi)有延展能力的血細胞為顆粒血細胞和漿血細胞,但具有噬菌作用的血細胞只有顆粒血細胞。半閉彎尾姬蜂自然寄生小菜蛾幼蟲時,在寄生后短時間內(nèi)可抑制血細胞的延展性,但當寄生后24h,血細胞的延展能力又可得到恢復(fù)(Huangetal.,2009)。本文結(jié)果再次證實了這一結(jié)論,同時發(fā)現(xiàn)雖然在寄生后1h內(nèi)顆粒血細胞沒有延展,但其表面仍能夠粘附大量的大腸桿菌但卻未進行進一步的吞噬作用;寄生后24h,當血細胞可延展時,噬菌作用也可順利進行。比較分析以上兩個現(xiàn)象,可以說明具有噬菌功能的顆粒血細胞表面的外源物識別受體并沒有受到寄生因子的破壞,但因血細胞的細胞膜無法延展而進行重構(gòu)內(nèi)陷,從而阻礙了噬菌過程的完成。因此,半閉彎尾姬蜂寄生通過暫時性地抑制寄主顆粒血細胞的延展性從而影響其噬菌過程。Huang等(2009)研究表明,半閉彎尾姬蜂寄生后短時間內(nèi)小菜蛾幼蟲功能血細胞無法進行包囊的主要原因之一是血細胞延展力受到抑制,而本文結(jié)果則再次證實暫時性抑制血細胞延展是半閉彎