酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究與應(yīng)用

酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究與應(yīng)用

人類對(duì)發(fā)酵菌的應(yīng)用，尤其是酒草，有著悠久的歷史，積累了大量生物和遺傳信息，考慮到細(xì)菌的興盛和其獨(dú)特的一些特點(diǎn)，它已發(fā)展成為一種評(píng)價(jià)外源基因的新過程。作為一種細(xì)胞生物，母乳素在操作和生產(chǎn)上具有不同的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。另一方面，它有一個(gè)過程中具有真核細(xì)胞融合過程和轉(zhuǎn)化后的蛋白。例如，二硫醇的正確形成。前體蛋白的水處理；糖基化等。以母乳素酶的存在為主要目的的糖轉(zhuǎn)移瘤的脫絲過程包括：酒草、啤酒母乳素、半血亞甲基母乳素、速尿、石蠟等。采用啤酒反應(yīng)體制的耶魯大學(xué)祖母。本文論述了祖母綜合征的現(xiàn)狀和應(yīng)用前景。1一些常見的螺母表達(dá)和沉積物1.1附加體型載體釀酒酵母(S.cerevisiae)很早就被應(yīng)用于食品和飲料工業(yè),也是人們最先建立的酵母表達(dá)系統(tǒng).自1981年Hitzeman等首次報(bào)道了人重組干擾素基因在釀酒酵母中表達(dá)成功后,相繼又有多種外源基因在該表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成功.目前已發(fā)展和建立了幾種該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體,但以整合體型(YIp-type)載體和附加體型(Yep-type)載體最為重要.整合型載體不含自主復(fù)制序列(ARS),而是被整合到酵母宿主菌的染色體上,這類載體的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性好,但它的缺點(diǎn)是拷貝數(shù)低.附加體型載體,由于含有來自酵母天然質(zhì)粒2μ復(fù)制起點(diǎn)序列,能夠獨(dú)立于酵母染色體外自主復(fù)制,拷貝數(shù)通?？蛇_(dá)30拷貝以上,但在非選擇條件下多不穩(wěn)定,發(fā)酵生產(chǎn)過程中質(zhì)粒丟失仍是問題.1.2乳酸克魯維度酵母外源基因的表達(dá)載體乳酸克魯維亞酵母(K.lactis)被作為工業(yè)化生產(chǎn)人用蛋白的安全微生物.利用乳酸克魯維亞酵母進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):(1)可以高密度發(fā)酵;(2)不需要甲醇防爆裝置;(3)工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)不降低生產(chǎn)率及酵母菌的再繁殖能力.乳酸克魯維亞酵母可以利用乳糖作為唯一的能源和碳源.由乳酸克魯維亞酵母LAC4基因編碼的半乳糖苷酶可使乳糖分解代謝.因此,在含有乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)乳糖利用途徑的酶類能夠被強(qiáng)烈誘導(dǎo).現(xiàn)已分離得到了LAC4啟動(dòng)子,外源基因就可以在它的調(diào)控下表達(dá).乳酸克魯維亞酵母的表達(dá)載體也是通過附加體型載體和整合體型載體來表達(dá)外源基因.附加體型載體有三種:(1)胞質(zhì)線性雙股DNA殺傷質(zhì)粒;(2)含有乳酸克魯維亞酵母ARS序列(稱KARS);(3)穩(wěn)定高拷貝數(shù)2μ樣pKD1和pKW1質(zhì)粒.第一種質(zhì)粒對(duì)外源蛋白的表達(dá)有限,因?yàn)榘|(zhì)線性雙股DNA殺傷質(zhì)粒pGKL1和pGKL2均是線性的,在其5′端含有共價(jià)結(jié)合的蛋白,因此在體外和大腸桿菌中操作復(fù)雜,限制了其作為表達(dá)外源蛋白載體的作用.KARS質(zhì)粒的主要問題是有絲分裂的不穩(wěn)定性.pKD1是一種環(huán)形質(zhì)粒,可在乳酸克魯維亞酵母中復(fù)制,并有穩(wěn)定的高拷貝數(shù)(70—100/每個(gè)細(xì)胞).其功能性結(jié)構(gòu)與釀酒酵母的2μ質(zhì)粒非常相似,甚至有一些相同的序列.Fleer等用pKD1載體成功地表達(dá)了人血清白蛋白和白細(xì)胞介素1β.但是人們也發(fā)現(xiàn)pKD1類載體是菌種依賴性的,并且受啟動(dòng)子和培養(yǎng)條件的影響很大.對(duì)于整合體型載體而言,表達(dá)盒被整合到克魯維亞酵母基因組中的LAC4位點(diǎn)或核糖體DNA重復(fù)序列中.這種整合方式不僅可以提高外源基因的穩(wěn)定性,還可以提高被整合基因的拷貝數(shù).1.3巴氏畢赤酵母基因檢測(cè)甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母(Methylotrophicyeast)包括:巴氏畢赤酵母(P.pastoris)和多形漢遜酵母(H.Polymorpha).1.3.1巴氏畢赤酵母是最近迅速發(fā)展起來的一種表達(dá)宿主.它以甲醇作為唯一的能源和碳源,可以在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng).甲醇能夠迅速誘導(dǎo)巴氏畢赤酵母合成大量的乙醇氧化酶(Alcoholoxidase,AOX).在巴氏畢赤酵母中有兩個(gè)基因編碼AOX,約占全部可溶性蛋白質(zhì)的30%以上.AOX1基因嚴(yán)格地受甲醇的誘導(dǎo)和調(diào)控,AOX2基因與AOX1基因序列相似,有92%的同源性,其編碼蛋白質(zhì)有97%的同源性.AOX1基因的編碼產(chǎn)物在氧化過程中起主要作用.甲醇能誘導(dǎo)AOX的合成,而甘油和葡萄糖則抑制AOX的產(chǎn)生,只有在去除其它能源后,利用甲醇誘導(dǎo)才能啟動(dòng)AOX1基因的信號(hào)轉(zhuǎn)錄和翻譯.典型的巴氏畢赤酵母表達(dá)載體含有乙醇氧化酶基因5′AOX1啟動(dòng)子、3′AOX1終止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn),以組氨醇脫氫酶(Histidinoldehydrogenase)基因HIS4作為互補(bǔ)篩選標(biāo)志或ZeocinR作為篩選標(biāo)志.作為一個(gè)能在大腸桿菌中繁殖、擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒,它還含有pBR322質(zhì)粒的部分序列和氨芐青霉素(AmpR)抗性基因的篩選標(biāo)志.表達(dá)載體通過同源重組整合到酵母細(xì)胞染色體DNA中.重組時(shí)用DNA內(nèi)切酶Bg1Ⅱ、DraⅠ和SalⅠ等線性化表達(dá)載體,使之整合于酵母基因組內(nèi)的AOX1基因的位置,整合后的外源基因隨酵母的生長(zhǎng)可穩(wěn)定地傳代存在.目前,Invitrogene公司已開發(fā)出多種巴氏畢赤酵母表達(dá)載體.如:pPIC9\,pHIL-D2\,pHIL-S1\,pPICZA,B,C系列和pPICZαA,B,C系列等適合于胞內(nèi)和分泌的表達(dá)載體.應(yīng)用巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)其表達(dá)載體含有特有的乙醇氧化酶(AOX)基因啟動(dòng)子,通過甲醇誘導(dǎo)AOX1調(diào)控外源基因的表達(dá);(2)可以高密度連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),外源蛋白表達(dá)量高;(3)根據(jù)載體類型,外源基因表達(dá)產(chǎn)物既可以在胞內(nèi)積聚又可以被分泌到培養(yǎng)基中,而分泌的外源蛋白占酵母細(xì)胞分泌蛋白的量大,利于工業(yè)生產(chǎn)和分離純化;(4)巴氏畢赤酵母能對(duì)所分泌的蛋白進(jìn)行N—、O—糖基化修飾且糖基化程度適中.1.3.2多形漢遜酵母是與巴氏畢赤酵母相似的另一甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母,在培養(yǎng)基中加入甲醇后迅速誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中的一些酶類產(chǎn)生.而在含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),這些酶的合成是受抑制的.當(dāng)用甲醇誘導(dǎo)后,三個(gè)關(guān)鍵酶:甲醇氧化酶(Methanoloxidase,MOX);甲酸脫氫酶(Formatedehydrogenase,FMD)和雙羥丙酮合成酶(Dihydroxyacetonesynthase,DHAS)可達(dá)菌體胞內(nèi)總蛋白的20-30%,若該培養(yǎng)基中含有低于0.3%的甘油情況下,這些酶可達(dá)30%以上.目前編碼這些關(guān)鍵酶的基因已被克隆,并用于調(diào)控外源基因的表達(dá).Gellissen等將來自西方許旺氏酵母的葡糖淀粉酶(glucomylase)外源基因,其中包括信號(hào)肽克隆到多形漢遜酵母表達(dá)載體pFMD-22a的FMD啟動(dòng)子和MOX終止子之間的多克隆位點(diǎn),在FMD啟動(dòng)子的控制下,外源基因被有效地分泌表達(dá),表達(dá)量為1.4g/L.此外,多形漢遜酵母中,外源基因可以通過非同源重組以首尾相接排列,整合到多形漢遜酵母染色體DNA中形成多拷貝基因的重組菌.與巴氏畢赤酵母相比,多形漢遜酵母對(duì)外源基因的表達(dá)可以受強(qiáng)啟動(dòng)子FMD和MOX的調(diào)控,而且在含甘油的培養(yǎng)基中加入甲醇也可以誘導(dǎo)外源基因的高表達(dá),從而避免了兩步發(fā)酵工藝.多形漢遜酵母表達(dá)載體的信號(hào)肽序列一是來自外源基因自身的信號(hào)肽.另一個(gè)是來自釀酒酵母的MFα.該信號(hào)序列融合到KFX2識(shí)別位點(diǎn).在蛋白分泌過程中,KEX2識(shí)別該序列并切除信號(hào)肽部分.2調(diào)控型強(qiáng)啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)化合適酵母宿主細(xì)胞的酵母表達(dá)載體均為大腸桿菌和酵母菌的“穿梭”質(zhì)粒.它是由來自酵母的部分基因序列和細(xì)菌的部分基因序列所組成.其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列.這兩個(gè)部分主要是作為在大腸桿菌宿主時(shí)增殖和篩選組分.酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分,主要是與宿主互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因序列(如:HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如:抗Zeocin的基因序列),以及編碼特定蛋白的基因啟動(dòng)子和終止子序列.作為一個(gè)表達(dá)型載體,需要一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)元件,人們根據(jù)不同酵母菌的研究已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)可以利用的強(qiáng)啟動(dòng)子.如:釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1,PHO5,CUP1等;巴氏畢赤酵母啟動(dòng)子AOX1已被克隆用于外源基因的表達(dá);克魯維亞酵母能利用乳糖,因?yàn)樗蠰AC4基因編碼β半乳糖苷酶,它的啟動(dòng)子證明是調(diào)控型強(qiáng)啟動(dòng)子;多形漢遜酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子MOX和FMD啟動(dòng)子也被用于外源基因的表達(dá).分泌型表達(dá)載體中帶有信號(hào)肽序列,其編碼信號(hào)肽的DNA序列已和表達(dá)框架一起構(gòu)建到載體中.所以,外源蛋白在酵母分泌表達(dá)時(shí)可以使用異源信號(hào)肽或酵母自身信號(hào)肽.有研究表明,自身信號(hào)肽可能要優(yōu)于異源信號(hào)肽.但是外源蛋白在酵母系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)選擇一個(gè)合適的信號(hào)肽是相當(dāng)復(fù)雜的.對(duì)于有些蛋白自身信號(hào)肽可以引導(dǎo)分泌表達(dá),如:人血清白蛋白(HAS)、蔗糖酶和牛溶菌酶,而以MFα作為異源信號(hào)肽在酵母中分泌表達(dá)外源蛋白也非常有效,尤其是對(duì)較小分子蛋白產(chǎn)物的分泌表達(dá),如:表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血液因子Ⅻ、單鏈抗體片段等.酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體主要分為附加體型載體和整合體型載體兩種.如:釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)多為附加體型載體,巴氏畢赤酵母、多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)為整合型載體,克魯維亞酵母表達(dá)系統(tǒng)則兼而有之.附加體型載體在酵母宿主中的拷貝數(shù)量大,但是在傳代過程中易丟失,影響重組菌的穩(wěn)定性和表達(dá)量.整合體型載體導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞后與酵母細(xì)胞染色體基因組DNA整合,因此穩(wěn)定性高,但是基因的拷貝數(shù)量低.通過整合體型載體上介導(dǎo)的整合序列為基因組中的重復(fù)序列,也能獲得多拷貝基因的重組子,也可以人工構(gòu)建串聯(lián)重復(fù)的多拷貝基因,然后再轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞,形成多拷貝基因的重組子.3釀酒酵母糖蛋白的糖基化加到分泌蛋白上的碳水化合物的結(jié)構(gòu)是微生物本身決定的.由釀酒酵母宿主分泌的多數(shù)外源蛋白,均是過度糖基化的(>40個(gè)甘露糖殘基).但是,在甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)通常不存在這種情況,巴氏畢赤酵母分泌表達(dá)糖蛋白的寡糖鏈平均長(zhǎng)度大約是8~14個(gè)甘露糖殘基.由此導(dǎo)致不同酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌糖蛋白的分子量不同.巴氏畢赤酵母分泌表達(dá)蔗糖酶的分子量約為85~90KD,而由釀酒酵母宿主分泌蔗糖酶的分子量約為100~140KD.與釀酒酵母的情況相比,巴氏畢赤酵母和多形漢遜酵母分泌的蔗糖酶并無過度的糖基化.多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)所分泌的異源西方許旺氏酵母葡萄糖淀粉酶中有N-、O-糖基化,但無過度糖基化的現(xiàn)象.西方許旺氏酵母分泌的糖蛋白也無過度糖基化現(xiàn)象.來自該酵母的天然糖蛋白僅含蛋白分子量的10~15%的N-連接碳水化合物.耶魯酵母分泌的(tPA)僅含短的寡糖鏈(8~10個(gè)甘露糖殘基).另外,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和巴氏畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)分泌的糖蛋白在寡糖鏈的結(jié)構(gòu)上有區(qū)別,巴氏畢赤酵母分泌的蔗糖酶(糖蛋白)的聚糖末端不含α-1,3連接的甘露糖殘基,而這種形式的糖殘基恰是釀酒酵母所分泌的糖蛋白末端的特點(diǎn).這種糖蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性.因此,釀酒酵母分泌的外源糖蛋白不適合作為藥物治療使用.4酵母外源基因表達(dá)系統(tǒng)自80年代初,Hitzeman等首次應(yīng)用釀酒酵母表達(dá)了人干擾素基因以來,應(yīng)用酵母這種單細(xì)胞真核生物表達(dá)外源基因越來越受重視.建成了多種基因表達(dá)系統(tǒng),成功地表達(dá)了多種蛋白.尤其近幾年,巴氏畢赤酵母、克魯維亞酵母和多形漢遜酵母由于其自身旺盛的生長(zhǎng)能力和獨(dú)有的一些生物學(xué)特性,更為眾多的研究者所關(guān)注.巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已被證明是既可以用于分泌表達(dá)又可以胞內(nèi)表達(dá)外源基因的一個(gè)理想的酵母表達(dá)系統(tǒng).它有強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1,完善的分子生物學(xué)操作方法,成熟的高密度發(fā)酵技術(shù),已成為生產(chǎn)商業(yè)化蛋白的重要表達(dá)系統(tǒng)之一.利用其強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1已經(jīng)高效表達(dá)了多種外源基因,如:腫瘤壞死因子、破傷風(fēng)毒素C片段、蔗糖酶、人血清白蛋白、蛋白酶抑制因子等基因的表達(dá)產(chǎn)物都超過每升發(fā)酵液1g的水平.其中腫瘤壞死因子和破傷風(fēng)毒素C片段每升發(fā)酵液可高達(dá)10g以上.利用克魯維亞酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功地表達(dá)了牛凝乳酶、人血清白蛋白、IL-1β