青蒿素對小鼠lewis肺癌生長和淋巴管生成的影響

青蒿素對小鼠lewis肺癌生長和淋巴管生成的影響

0青蒿素抑制淋巴管生成的作用機(jī)制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是多種腫瘤轉(zhuǎn)移的重要手段，也是腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。近年來的研究表明，腫瘤可以誘導(dǎo)淋巴管的生成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過新的淋巴管向區(qū)域內(nèi)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)在，從各種淋巴管內(nèi)部特征的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了對腫瘤淋巴管功能的理解。因此，人們可以識別抑制淋巴管生成的藥物和方法，這是腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。1972年，中國科學(xué)家在中藥青蒿中分離了具有抗瘧疾作用的單一成分“苦艾酒”。目前，它主要用于治療抗癲癇藥物引起的惡性瘧疾。多項(xiàng)研究表明，苦艾酒及其衍生物對各種腫瘤的生長有抑制作用，并表明它們具有很強(qiáng)的抗血管生成功能。然而，尚不清楚什么樣的苦艾酒是否能抑制淋巴管的生成。我們討論了苦艾酒對大鼠lewis肺癌生長、淋巴管生成和肺轉(zhuǎn)移的影響。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和免疫健康C57BL/6小鼠50只,雌性,4～6周齡,體質(zhì)量18.1～20.3g,由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供.小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購于美國典型菌株保藏中心(ATCC),使用DMEM(含10mL/L滅活胎牛血清、100U/mL青、鏈霉素)培養(yǎng)基,置于37℃,50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng).DMEM、胎牛血清購于美國Hyclone公司.胰蛋白酶,美國BD公司.青蒿素購自重慶市酉陽縣武陵山制藥有限公司,研磨后用5g/L的羧甲基纖維素鈉配成懸浮液.兔抗小鼠VEGFR-3,LYVE-1多克隆抗體購買自美國SantaCruzBiotechnology公司.免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司.收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,胰酶消化后,1000r/min離心10min,PBS洗滌,無血清的DMEM制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到5×106.隨機(jī)選取6周齡的C57BL/6小鼠,在背部皮膚下接種Lewis肺癌細(xì)胞,每只0.1mL.1.2小鼠vegfr-3、lyvd-1、lvmd/hs-pcr檢測將20只小鼠隨機(jī)分為對照組和青蒿素治療組,每組10只,青蒿素治療組在腫瘤移植后2d即灌胃給予50mg/kg青蒿素0.4mL,1次/2d,連續(xù)給藥2wk;對照組灌胃相同體積的羧甲基纖維素鈉懸液.每2～3d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大長徑(a)和與之垂直的寬徑(b),并計(jì)算腫瘤體積:V=0.52ab2.移植后30d脫臼處死小鼠,剝離腫瘤組織,取出肺組織,稱取瘤體和肺質(zhì)量.肺組織用40g/L甲醛固定24h,石臘包埋,切片,常規(guī)HE染色,計(jì)算光鏡下的平均結(jié)節(jié)數(shù).另取30只小鼠隨機(jī)分為對照組和青蒿素治療組,每組15只,觀察生存期.腫瘤組織切片用二甲苯脫臘,梯度酒精水化,30mL/LH2O2室溫封閉10min,98℃微波熱修復(fù)抗原10min.SABC染色步驟如下:先用20mL/L正常山羊血清封閉30min,甩去不洗,隨后滴加兔抗小鼠VEGFR-3及LYVE-1(1∶500),4℃過夜,PBS洗滌,滴加生物素化的羊抗兔IgG(1∶100),37℃孵育30min,PBS洗滌,加入SABC,37℃孵育30min,DAB顯色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,蘇木素襯染,中性樹膠封片.光鏡下觀察微淋巴管密度(lymphaticmicrovesseldensity,LMVD)并計(jì)數(shù),參考Beasley等的方法,即先在低倍數(shù)下(×100)觀察切片,尋找腫瘤內(nèi)染成棕褐色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇,作為一個(gè)微淋巴管,含有肌層的細(xì)胞不以計(jì)數(shù),每個(gè)標(biāo)本在高倍鏡下(×400)隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野,取平均數(shù)作為該LMVD值.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料用xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析.兩率的比較用Fisher確切概率法,均數(shù)比較用t檢驗(yàn),生存率估計(jì)用Kaplan-Meier法,并用log-rank檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1兩組腫瘤生長和量測小鼠接種Lewis肺癌細(xì)胞后8d,在青蒿素治療組和對照組小鼠背側(cè)皮下均有肉眼可見的腫瘤病灶.接種后15d和20d腫瘤生長在兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,圖1).30d脫臼處死小鼠,稱量腫瘤重量,發(fā)現(xiàn)治療組和對照組腫瘤也無顯著差異(P>0.05,表1).2.2青蒿素對k-b間質(zhì)的影響通過檢測瘤周和瘤內(nèi)VEGFR-3和LYVE-1表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)VEGFR-3和LYVE-1主要表達(dá)在瘤周間質(zhì)(圖2A,B),定位于淋巴管內(nèi)皮表面,而在瘤內(nèi)表達(dá)極少,僅表達(dá)于少量腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞(圖2C,D).以LYVE-1陽性淋巴管計(jì)算LMVD,高倍鏡(×400)下顯示,青蒿素治療組平均LMVD為(9.8±4.2)個(gè),對照組為(34.8±6.5)個(gè),兩者之間具有顯著性差異(P<0.01,表1).2.3青蒿素對雙肺重量的影響脫臼處死接種后30d的小鼠,摘取雙肺,電子天平稱質(zhì)量,并制作石臘切片,HE染色觀察肺轉(zhuǎn)移灶.結(jié)果顯示,與對照組比較,青蒿素治療組雙肺重量明顯減輕(P<0.05,表1);而且青蒿素組雙肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為50%,對照組為100%,兩者具有顯著性差異(P<0.05,表1);此外,治療組雙肺轉(zhuǎn)移平均結(jié)節(jié)數(shù)和轉(zhuǎn)移灶大小也明顯小于對照組(P<0.01,表1).2.4青蒿素治療組與對照組的死亡情況青蒿素治療后觀察小鼠死亡情況,對照組荷瘤小鼠在19d開始死亡,在55d時(shí)全部死亡.青蒿素治療組在36d開始死亡,在60d時(shí)仍有73%存活,明顯高于對照組(P<0.01,圖3).3青蒿素的保護(hù)作用近年的研究證實(shí),腫瘤淋巴管生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),LMVD和微淋巴管浸潤(lymphanticvesselinvasion,LVI)是獨(dú)立的非小細(xì)胞肺癌預(yù)后指標(biāo).在實(shí)體腫瘤中,腫瘤細(xì)胞或其他間質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)-C,VEGF-D,通過激活VEGFR-3誘導(dǎo)淋巴管生成,增加的淋巴管密度使得腫瘤更容易進(jìn)入淋巴管從而運(yùn)輸?shù)絽^(qū)域淋巴結(jié).目前,人們已經(jīng)使用多種方法來靶向抑制VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信號通路,以期望通過抑制淋巴管生成從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移.然而,這些分子靶向措施目前還處于實(shí)驗(yàn)階段,用于臨床尚需時(shí)日.青蒿素是在世界范圍內(nèi)治療治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的主要藥物,副作用少.近年的研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用,而且可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、存活和體外血管形成.在一項(xiàng)體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯對腸道腫瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng),而對肺小細(xì)胞癌細(xì)胞的殺傷作用較弱,其作用強(qiáng)度不到腸腫瘤細(xì)胞和白血病腫瘤細(xì)胞的1/20.我們應(yīng)用Lewis肺癌模型,觀察了青蒿素對荷瘤小鼠的保護(hù)作用,結(jié)果顯示,50mg/kg的青蒿素可以顯著延長荷瘤小鼠生存期,但并未減輕腫瘤負(fù)荷.提示青蒿素對Lewis肺癌的抑制作用較弱,其保護(hù)作用可能不是由于它對腫瘤細(xì)胞具有直接的殺傷作用.VEGFR-3,LYVE-1,Prox-1,D2-40和Podoplanin是常用的淋巴內(nèi)皮標(biāo)記物,可以用于腫瘤LMVD計(jì)數(shù),從而評價(jià)肺癌患者的預(yù)后.我們使用VEGFR-3和LYVE-1免疫組化染色標(biāo)記微淋巴管,并以LYVE-1陽性管腔計(jì)數(shù)LMVD.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在Lewis肺癌內(nèi)少有VEGFR-3或LYVE-1陽性表達(dá),而在實(shí)體腫瘤周圍有大量新生的微淋巴管.某些研究認(rèn)為,瘤周高LMVD而不是瘤內(nèi)LMVD與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān);瘤體產(chǎn)生的靜水壓將瘤內(nèi)淋巴管壓扁使其不具有功能,而瘤周提供了一個(gè)潛在的低張、低壓和大容量環(huán)境,更有利于腫瘤細(xì)胞的滲透和播散.我們發(fā)現(xiàn)青蒿素治療組瘤周LMVD計(jì)數(shù)明顯少于對照組,提示青蒿素具有顯著的抗腫瘤淋巴管生成的作用.此外,由于Lewis移植瘤具有高轉(zhuǎn)移至肺的特點(diǎn);淋巴管生成與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也具有相關(guān)性,因此我們觀察了青蒿素對腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響,結(jié)果顯示青蒿素顯著降低肺轉(zhuǎn)移灶大小,并減少肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù).因此,青蒿素可能是通過抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移從而提高荷瘤小鼠存活率.關(guān)于青蒿素抗淋巴管生成的機(jī)制,我們認(rèn)為其與青蒿素的抗血管生成作用相類似,青蒿素可能從多種途徑發(fā)揮作用,如抑制腫瘤細(xì)胞VEGF-C