3種脫蛋白方法對蜘蛛香多糖總抗氧化能力的影響

3種脫蛋白方法對蜘蛛香多糖總抗氧化能力的影響

蜘蛛虱子。多糖是機體內(nèi)重要的生物大分子,研究表明多糖的抗氧化活性可能是其抗腫瘤、抗衰老、抗感染等功能的作用機制之一。為深入研究蜘蛛香多糖的抗氧化作用,須制備高純度產(chǎn)品。蛋白質(zhì)是粗多糖的主要雜質(zhì)之一,脫蛋白研究對多糖純化具有重要意義。粗多糖脫蛋白研究中,一般僅考察蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的變化,而忽視脫蛋白方法對多糖抗氧化活性的影響。本實驗以蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和總抗氧化能力損失率為指標,研究Sevag法、三氯乙酸法和鹽酸法對蜘蛛香多糖的影響,為純化高抗氧化活性蜘蛛香多糖奠定基礎(chǔ)。1抗氧化能力測試試劑蜘蛛香購于十堰市中藥材公司,產(chǎn)地湖北,經(jīng)鄖陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院唐微副教授鑒定;考馬斯亮藍G-250(美國Amresco公司);牛血清蛋白(美國Sigma公司);總抗氧化能力測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑為國產(chǎn)分析純。HH·SY11-Ni型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠);722S型可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);PHS-25型酸度計(上海雷磁儀器廠)。2方法2.1粗多糖的制備藥材烘干,粉碎,過40目篩,加入15倍85%乙醇,回流脫脂2h,抽濾并用85%乙醇洗6次,烘干備用。藥粉加水(料液比1∶10),于100℃浸提2次,每次5h,提取液濃縮至1/10體積,加入4倍90%乙醇,4℃靜置8h,4000r·min-1離心10min,沉淀依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌,干燥得粗多糖。稱取3.75g粗多糖加水溶解并定容至500mL,得蜘蛛香粗多糖溶液。2.2牛血清蛋白標準曲線以考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量。以牛血清蛋白(100mg·L-1)作標準曲線,牛血清蛋白質(zhì)量分數(shù)為橫坐標,595nm吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程Y=0.007X+0.0086,r=0.9992。2.3標準曲線的繪制以蒽酮-硫酸法測定多糖含量。以葡萄糖(100mg·L-1)作標準曲線,葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為橫坐標,620nm吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程Y=0.007X-0.001,r=0.9997。2.4抗氧化能力測試采用鐵還原(FRAP)法測定多糖總抗氧化能力。抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+,后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,通過比色法可測出其抗氧化能力的高低。按總抗氧化能力測定試劑盒說明書準備工作液,按試劑盒操作表(見表1)操作,520nm處測定吸光度。在37℃時,每min每mL樣品液使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01,為一個抗氧化能力單位。2.5多糖質(zhì)量分數(shù)式中,P1,R1,O1分別為原多糖液蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、多糖質(zhì)量分數(shù)和總抗氧化能力;P2,R2,O2分別為脫蛋白后多糖液蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、多糖質(zhì)量分數(shù)和總抗氧化能力。2.6利用三氯甲烷和0.4倍體積正丁醇對全球視野的測定取粗多糖溶液75mL于250mL錐形瓶中,加雙蒸水稀釋至150mL,加入0.2倍體積三氯甲烷和0.04倍體積正丁醇,磁力攪拌30min,4000r·min-1離心10min,取少量上層清液進行測定,剩余上層清液再加入0.2倍體積三氯甲烷和0.04倍體積正丁醇,重復(fù)處理數(shù)次。2.7三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)的測定取粗多糖溶液10份各20mL于50mL燒杯中,以1:1體積加入三氯乙酸溶液,使其質(zhì)量分數(shù)分別為1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,攪勻,4℃靜置12h,4000r·min-1離心10min,上清液定容至50mL進行測定。2.8測定方法取粗多糖溶液6份各20mL于50mL燒杯中,分別加入20mL雙蒸水并用0.2mol·L-1鹽酸調(diào)pH至2,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,混勻,4℃靜置12h,4000r·min-1離心10min,上清液定容至50mL進行測定。3結(jié)果3.1去除蛋白質(zhì)對多糖結(jié)構(gòu)的破壞Sevag法是利用一定比例的三氯甲烷和正丁醇使蛋白質(zhì)變性乳化,離心后變性蛋白質(zhì)處于水相和有機相之間,可溫和地除去蛋白質(zhì),對多糖結(jié)構(gòu)的破壞較小。由圖1可知,Sevag法蛋白質(zhì)脫除率隨處理次數(shù)增加顯著升高,多糖損失率和總抗氧化能力損失率緩慢升高。Sevag法處理6次后粗多糖蛋白質(zhì)脫除率達最高為41.71%,多糖損失率為46.38%,總抗氧化能力損失率為11.62%,多糖損失率遠高于總抗氧化能力損失率,說明損失的多糖抗氧化能力較低。3.2氯乙酸質(zhì)量分數(shù)對多糖抗氧化能力的影響三氯乙酸為有機酸,可使蛋白質(zhì)變性并結(jié)合生成不溶性的鹽類。由圖2可知,三氯乙酸法的多糖損失率較低,三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)為1%時,多糖損失率為2.71%,質(zhì)量分數(shù)為6%時,多糖損失率達最高為6.53%。三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)對多糖總抗氧化能力影響較大,質(zhì)量分數(shù)為1%時,總抗氧化能力損失率為9.96%,質(zhì)量分數(shù)升至10%時,總抗氧化能力損失率達最高為64.73%,說明高質(zhì)量分數(shù)三氯乙酸對多糖活性結(jié)構(gòu)破壞嚴重。三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)為7%時,蛋白質(zhì)脫除率達最高為48.84%,多糖損失率為4.72%,總抗氧化能力損失率為58.09%。3.3抗氧化能力損失率由圖3可知,用鹽酸調(diào)節(jié)多糖溶液pH值,隨著pH值降低,蛋白質(zhì)脫除率逐漸升高,多糖損失率變化不大,總抗氧化能力損失率逐漸增高。pH值為2時,蛋白質(zhì)脫除率達最高為45.38%,多糖損失率為6.73%,總抗氧化能力損失率為20.75%。3.43不同方法的結(jié)果的比較4脫蛋白及抗氧化活性評價多糖組成復(fù)雜,種類繁多,生物學活性差異較大,如何分離純化得到高純度、高活性的多糖是多糖研究的難題。李貴榮研究發(fā)現(xiàn)純化后的枸杞多糖清除活性自由基能力低于粗多糖。許多多糖產(chǎn)品僅僅停留在保健品階段,未能開發(fā)成藥物,主要原因是多糖的分離純化困難,國內(nèi)一度出現(xiàn)了“多糖越純,活性越小”的論點,這是因為用了錯誤的分離方法。脫蛋白為多糖純化的重要環(huán)節(jié),若僅以蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率為指標選擇脫蛋白方法難以獲得高活性多糖。本實驗以蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和總抗氧化能力損失率綜合考察常用的3種脫蛋白質(zhì)方法對蜘蛛香多糖的影響,發(fā)現(xiàn)三氯乙酸法和鹽酸法的蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率指標均優(yōu)于Sevag法,但這兩種方法導致多糖總抗氧化能力損失較大,可能在酸性條件下抗氧化多糖結(jié)構(gòu)易被破壞;Sevag法對蜘蛛香多糖總抗氧化能力影響最小,不僅脫除蛋白質(zhì)也能去除一些抗氧化活性較低的多糖,利于蜘蛛香抗氧化多糖的純化,但其蛋白質(zhì)脫除率僅為41.71%,要進一步脫除蛋白質(zhì)其工藝還需優(yōu)化。中藥成分抗氧化活性評價的方法有二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法、硫代巴比妥酸(TBA)法、FRAP法和生物發(fā)光法等。本實驗采用簡單的FRAP法評價多糖的抗氧化能力,以期簡便地篩選出合適的脫蛋白方法,為高抗氧化活性多糖的純化提供新的思路。由圖4可知,若僅考慮蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率,三氯乙酸法明顯優(yōu)于Sevag法和鹽酸法,但其總抗氧化能力損失率最高,