不同收集方式對異育銀鯽消化率測定結(jié)果的影響

不同收集方式對異育銀鯽消化率測定結(jié)果的影響

消化率是指動物從食物中吸收的總營養(yǎng)成本的比例。消化率的高低是評價(jià)飼料營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,飼料消化率不僅是評價(jià)飼料營養(yǎng)價(jià)值和測定配合飼料利用效率的方法之一;同時(shí)對于飼料配方的合理配置、魚類營養(yǎng)物質(zhì)需要量的研究和飼料對水環(huán)境的影響評估等均具有重要價(jià)值。研究消化率的方法有體內(nèi)消化法和體外消化法兩大類,體內(nèi)消化法又包括直接法和間接法,現(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的是根據(jù)飼料和糞便中的指示劑含量(%)來間接計(jì)算消化率的間接指示劑法。與畜禽類的研究不同,由于水產(chǎn)動物生活環(huán)境的特殊性使得糞便中的營養(yǎng)成分和無機(jī)物質(zhì)在收集時(shí)容易在水中溶失,因此,水產(chǎn)動物糞便的收集方法與消化率測定結(jié)果的準(zhǔn)確性密切相關(guān)。迄今為止,魚類營養(yǎng)學(xué)家們根據(jù)不同需要已摸索出多種水產(chǎn)動物糞便收集方法:解剖法、擠壓法、肛吸法、虹吸法、連續(xù)過濾法、傾析法、代謝室法、網(wǎng)撈法、積糞器法、沉積柱法等,這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。擠壓法、解剖法和肛門吸糞法屬于體內(nèi)采糞法,雖然可以避免營養(yǎng)成分在水中丟失,但是這些方法需頻繁捕捉實(shí)驗(yàn)魚會造成魚類的應(yīng)激反應(yīng),采集的糞樣不能完全代表自然狀況下排出的糞便;并且混在腸內(nèi)未消化物質(zhì)以及消化過程中體內(nèi)分泌的消化液、黏液、消化道脫落的上皮細(xì)胞及腸內(nèi)微生物等成分會使測得的消化率值低于真實(shí)值。立即吸移法、連續(xù)過濾法和傾析法等都是從水體中收集實(shí)驗(yàn)魚排出的糞便,營養(yǎng)物質(zhì)在水體中有一定程度的溶失,使測得的消化率值高于真實(shí)值。因此,為了方便不同實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)之間的比較以及可靠的糞便收集方法的建立,必須對魚飼料消化率測定中糞便收集方法引起的誤差進(jìn)行比較。虹吸法是一種操作簡單的糞便收集方法,在魚類養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中被廣泛采用。但是因操作過程會帶入溶失誤差而廣受爭議。國外有學(xué)者認(rèn)為后腸取糞法是比較可靠的糞便收集方法,但是不同魚種的腸道取樣段長度不好統(tǒng)一,容易帶入腸道未消化物或者腸道黏液的污染,且僅代表魚體一次攝食的消化狀況,不能像虹吸法一樣可以對消化率的變化進(jìn)行長期監(jiān)測。積糞器法的采用是出于更加真實(shí)地評價(jià)消化率的需要,各實(shí)驗(yàn)室對積糞器法均有相應(yīng)的改良措施,但是總的來說操作煩瑣,只能作為對其他糞便收集方法準(zhǔn)確性評價(jià)的一種收糞方法,不適合廣泛采用。本實(shí)驗(yàn)以異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)為研究對象,評價(jià)積糞器法、虹吸法和后腸取糞法對表觀消化率(ADC)測定結(jié)果的影響,同時(shí)準(zhǔn)確評價(jià)異育銀鯽攝食后排糞高峰的出現(xiàn)時(shí)間以及排糞持續(xù)時(shí)間。1材料和方法1.1后腸取糞法見表1本實(shí)驗(yàn)評價(jià)3種收集糞便方法(積糞器法、虹吸法和后腸取糞法)對異育銀鯽飼料消化率測定的影響。不同的收集處理方式在同批實(shí)驗(yàn)魚中按積糞器法、虹吸法和后腸取糞法的順序依次進(jìn)行。在積糞器法中采取每小時(shí)連續(xù)采糞方式,通過糞便重量的變化準(zhǔn)確評價(jià)異育銀鯽攝食后的排糞高峰和排糞持續(xù)時(shí)間,同時(shí)也為虹吸法和后腸取糞法取糞時(shí)間的設(shè)置提供依據(jù)。積糞器法中每次僅收集1h內(nèi)魚體排泄的糞便,采集的糞便樣很新鮮而且糞便不像虹吸法那樣受到魚體活動的干擾和虹吸力量的影響,測定的ADC值相對客觀,因此本研究以改良的積糞器法收集糞便測定的ADC作為參照標(biāo)準(zhǔn),用以比較虹吸法及后腸取糞法對應(yīng)的測定值與其的差異性。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和設(shè)備實(shí)驗(yàn)魚:實(shí)驗(yàn)所用魚為規(guī)格均勻的異育銀鯽(體重約100g),購自湖北洪湖養(yǎng)殖場。實(shí)驗(yàn)飼料:以魚粉為蛋白源,魚油及植物油為脂肪源,三氧化二鉻(Cr2O3)為指示劑自制實(shí)驗(yàn)飼料,配方及成分(表1)。飼料由本實(shí)驗(yàn)室的小型制粒機(jī)加工成直徑為3mm的濕顆粒,60℃烘干后保存在-4℃的冰柜中備用。實(shí)驗(yàn)條件:本實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的4個(gè)圓形玻璃纖維養(yǎng)殖缸(直徑:150cm,高:120cm,容積:2000L)以及8個(gè)糞便積糞器中進(jìn)行。采用的積糞器為實(shí)驗(yàn)室簡易制備裝置,主要包括魚活動區(qū)、錐形集糞區(qū)和收糞閥等裝置(圖1)。為了避免魚體活動對糞便的攪動,本實(shí)驗(yàn)室通過設(shè)置隔離集糞區(qū)的方式對積糞器進(jìn)行了合理改良,魚活動區(qū)和積糞區(qū)之間設(shè)置帶孔隔板,保證糞便不受魚活動的干擾(隔板的孔隙足夠大,使糞便不易掛在隔板上且實(shí)驗(yàn)魚不能穿過)。在實(shí)驗(yàn)期間水溫變動范圍是23.5—25.0℃;光照周期為12L/12D(8:00到20:00);溶氧高于6mg/L;氨氮(NH4-N和NH3-N)濃度小于0.5mg/L;pH約為7.1。1.3實(shí)驗(yàn)過程與分析方法實(shí)驗(yàn)魚的馴養(yǎng)購回的實(shí)驗(yàn)魚用2%食鹽水消毒后放入室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)馴養(yǎng)。馴養(yǎng)期間,投喂暫養(yǎng)料(不含Cr2O3,其他與實(shí)驗(yàn)飼料同),每天飽食投喂兩次(09:00和15:00),馴養(yǎng)期為一個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)前一周改投實(shí)驗(yàn)飼料。積糞器法測定異育銀鯽排糞高峰時(shí)間以及持續(xù)時(shí)間一次投喂結(jié)束后將馴養(yǎng)缸中的實(shí)驗(yàn)魚分轉(zhuǎn)到8個(gè)積糞器中,每個(gè)積糞器放8尾魚。在投喂結(jié)束后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、24h末分別收集糞便。由于糞便量的限制,8個(gè)積糞器采取隨機(jī)四四合并的方法組成兩個(gè)平行糞便樣。各采糞時(shí)間收集到糞便樣于70℃烘干至恒重,稱重并記錄下各時(shí)段的糞便重量用于分析異育銀鯽攝食后的排糞高峰。干燥的糞便樣品于-4℃冰箱中保存。用馴養(yǎng)缸的實(shí)驗(yàn)魚重復(fù)第一輪實(shí)驗(yàn)的過程,又得兩個(gè)平行樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將積糞器中的魚返回至養(yǎng)殖缸正常投喂管理經(jīng)歷一周的恢復(fù)期。實(shí)驗(yàn)前將魚饑餓2d,然后重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)過程一次。得到饑餓組異育銀鯽在攝食后不同時(shí)間的糞便樣,用于比較其排糞動態(tài)與正常攝食組的區(qū)別。虹吸法收集糞便積糞器法采糞的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,讓養(yǎng)殖缸中的實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)一周。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),分別在一次投喂結(jié)束后的第2、5、8、11h用虹吸法收集糞便,從虹吸出的糞便中挑選出完整有包膜的新鮮糞便條,于70℃烘干至恒重后于-4℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3d以收到足夠的糞便樣。后腸取糞法收集糞便一次投喂結(jié)束后,依據(jù)排糞動態(tài)的數(shù)據(jù),選擇在投喂結(jié)束后第5h將實(shí)驗(yàn)魚撈起,剖腹取出腸道,將總腸三分之一對折,截取最后端的三分之一。擠出其中的糞便于清水中輕輕漂洗以除去表面的腸道黏液,然后將糞便挑出于70℃烘干至恒重,放于-4℃冰箱中保存。生化分析干燥的飼料和糞便樣均碾磨成粉狀樣品用于化學(xué)分析。測定的生化成分包括飼料的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、灰分、能量以及Cr2O3含量;糞便的粗蛋白及Cr2O3含量。以上參數(shù)的測定均參照AOAC的方法。干物質(zhì)含量通過在105℃下烘烤至恒重測得。粗蛋白含量用凱氏定氮儀(2300KjeltecAnalyzerUnit,FOSSTECATOR,Sweden)測定;粗脂肪用索氏抽提儀(SoxtocsystemHT6,Tecator,Haganas,Sweden)以乙醚為溶劑測定;灰分在馬福爐中550℃下充分灼燒測得;能值用Phillipson能量計(jì)(Phillipsonmicrobombcalorimeter,Aiken,USA)測定。Cr2O3的測定用Bolin,etal.的酸消化法。每個(gè)樣品測定兩個(gè)平行樣。計(jì)算公式與統(tǒng)計(jì)分析干物質(zhì)表觀消化率(ADCd,%)=100-100×C1/C2上述公式中C1為飼料中Cr2O3的百分含量;C2為魚糞便樣中Cr2O3的百分含量;N1為飼料中粗蛋白百分含量;N2為糞便中粗蛋白的百分含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Statistica6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一元方差分析(One-wayANOVA),顯著水平為P<0.05。若結(jié)果差異顯著再進(jìn)行鄧肯多重比較(Duncan’smultiplerangetests)。2結(jié)果2.1正常攝食和不良攝食后排糞的持續(xù)時(shí)間比較如圖2所示,正常攝食的異育銀鯽的排糞高峰期出現(xiàn)在攝食結(jié)束后的5—10h;排糞的持續(xù)時(shí)間大致是15h。如圖3所示,饑餓2d的異育銀鯽攝食后排糞的高峰期出現(xiàn)在攝食結(jié)束后的7—9h;排糞的持續(xù)時(shí)間大致是15h。比較圖2和圖3可得:正常攝食組與饑餓組的異育銀鯽一次攝食以后排糞高峰期出現(xiàn)的時(shí)間和排糞持續(xù)時(shí)間比較一致。但是圖2顯示正常攝食的異育銀鯽排糞高峰曲線的峰型較寬,高峰期持續(xù)時(shí)間較長,且出現(xiàn)兩個(gè)排糞高峰;而圖3顯示饑餓組的峰型比較陡峭,高峰期持續(xù)時(shí)間較短。2.2糞樣中各收集方法的確定通過測定飼料和糞便樣的粗蛋白和Cr2O3含量,計(jì)算得各種糞便收集方式下的干物質(zhì)表觀消化率(ADCofdrymatter,ADCd)和蛋白表觀消化率(ADCofprotein,ADCp)。由圖4可以看出,異育銀鯽的ADCd和ADCp在排糞初始階段較低,隨著排糞高峰期的出現(xiàn)而升高。如表2所示,糞便的不同收集方法和不同收集時(shí)間對異育銀鯽ADCd和ADCp的測定均存在顯著影響(P<0.05)。由表2可知,采用積糞器法在排糞初始時(shí)段內(nèi)收集糞便測得的ADCd(69.85%—73.41%)低于排糞高峰期內(nèi)的測定值(76.68%—77.15%);采用虹吸法收集糞便測得的ADCd(76.04%—77.39%)與在積糞器法排糞高峰期的測定值(76.68%—77.15%)基本一致;采用后腸取糞法收集糞便測得的ADCd(74.36%)低于虹吸法(76.04%—77.39%)和積糞器法排糞高峰期的測定值(76.68%—77.15%)。由表2可知,采用積糞器法在排糞初始時(shí)段內(nèi)收集糞便測得的ADCp(90.83%—91.80%)低于排糞高峰期內(nèi)的測定值(93.08%—96.01%);采用虹吸法收集糞便測得的ADCp(91.14%—91.90%)低于在積糞器法排糞高峰期的測定值(93.08%—96.01%);采用后腸取糞法收集糞便測得的ADCp(88.88%)低于另外兩種收糞方法下各采糞時(shí)間的測定值。3討論3.1排糞規(guī)律測定不同魚類攝食后排糞高峰出現(xiàn)時(shí)間有所不同大多數(shù)學(xué)者采用眼觀法目測實(shí)驗(yàn)對象的排糞高峰。本實(shí)驗(yàn)精確測量了異育銀鯽一次攝食后排糞量的變化情況,由此評定異育銀鯽的排糞高峰和排糞持續(xù)時(shí)間。異育銀鯽是無胃魚,據(jù)觀察發(fā)現(xiàn),它們與有胃魚不同,可以不斷攝食和排糞。正常攝食的異育銀鯽排糞高峰曲線圖之所以峰型較寬并且存在兩個(gè)高峰,可能是受前一天攝食積累影響的結(jié)果。在攝食時(shí)它們的腸道是未排空的,所以會出現(xiàn)高峰的疊加并且高峰期持續(xù)時(shí)間較長。而饑餓2d后的異育銀鯽的腸道已大致排空,所以該排糞高峰曲線不會受到腸道內(nèi)前期積累物的干擾,峰型較陡峭,且高峰持續(xù)時(shí)間較短。3.2異育銀蚤對飼料消化率的影響很多生態(tài)因子都會影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化率,在有關(guān)的研究中人們著重探討了體重、水溫、以及食物的性質(zhì)及攝入量等因子對消化率的影響作用。本實(shí)驗(yàn)在積糞器法中探討了糞便收集時(shí)間對測定異育銀鯽飼料消化率的影響。研究結(jié)果表明,異育銀鯽對飼料的ADCd和ADCp在排糞初始階段比較低,隨排糞高峰的出現(xiàn)而逐漸增加。這可能主要與異育銀鯽自身消化酶的分泌動態(tài)有關(guān):攝食后,食物逐漸到達(dá)消化系統(tǒng)中部,對消化系統(tǒng)的刺激逐漸增強(qiáng),消化酶的分泌會逐漸增加,此時(shí)魚體的消化能力漸增,同時(shí)逐漸到達(dá)排糞高峰;當(dāng)食物大部分被消化后,消化酶的分泌會逐漸減少,此時(shí)魚體的消化能力漸減,排糞量逐漸減少。所以采取在排糞高峰期收集糞便能夠更真實(shí)的反應(yīng)魚類穩(wěn)定的消化生理狀況。因此在本實(shí)驗(yàn)中我們將積糞器法排糞高峰期收集糞便的ADC測定值作為標(biāo)準(zhǔn)參照。3.3腸道取樣段的管理糞便的不同收集方法對消化率測定影響的研究在不同魚的報(bào)道中比較一致。一般來講,解剖法和擠壓法之間的干物質(zhì)、蛋白和脂肪的消化率無明顯不同。體外集糞法由于營養(yǎng)物質(zhì)溶于水中測得的消化率要高于以上所有方法。此外也有作者認(rèn)為體外集糞法的消化率低于擠壓法或與解剖法之間的消化率沒有差異。與積糞器法排糞高峰期ADCd的測定值相比,本實(shí)驗(yàn)虹吸法測得的ADCd與其相當(dāng),而后腸取糞法的ADCd測定值偏低。這是由于不同魚類腸道長度不同,以腸道末端1/3作為后腸取樣段,很容易因未完全消化的食糜物質(zhì)混入而導(dǎo)致消化率測定偏低。腸道取樣段的控制是后腸取糞法的弊端所在。虹吸法測得的ADCp與積糞器法排糞高峰期ADCp的測定值相比,沒有呈現(xiàn)糞便氮溶失帶來的明顯影響;同ADCd類似,后腸取糞法依然顯示了體液或者未消化完全成分污染的影響,測得偏低的ADCp。這為虹吸法的廣泛應(yīng)用提供了有力依據(jù)。虹吸法是一種非常簡便的糞便收集方法,并且對魚的干擾很小,在魚類營養(yǎng)學(xué)的研究工作中被廣泛應(yīng)用。但是也有學(xué)者指出虹吸法存在大量營養(yǎng)物的溶失,可靠性不高。Smith和Lovell就曾指出虹吸法收集糞便會顯著影響斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunct