靈芝中的多糖肽及其抗腫瘤作用

靈芝中的多糖肽及其抗腫瘤作用

2000多年在中國(guó)的應(yīng)用，許多流行的實(shí)踐表明，癲癇對(duì)各種疾病都有明顯的治療效果。主要治療成分是（ganordicmaliusaeconomica）。glp是由蘑菇和提取的子實(shí)體，由鄧氏菌、葡聚糖和各種茶多酚組成。它們是癲癇的主要有效成分之一，尤其是glp對(duì)藥理學(xué)的廣泛活性。它可以改善身體的免疫功能，腫瘤和其他疾病。1關(guān)于glp腫瘤的藥理學(xué)研究1.1glp的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)及形成《中國(guó)藥典》2000年版首次收錄了靈芝(包括赤芝、紫芝)。GLP的化學(xué)成分主要從赤靈芝(GanodermalucidumKarst)的子實(shí)體中分離得到一種具有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分裂的多糖,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為718000,不含蛋白質(zhì),是一種自由D-葡萄糖組成的具有β-(1-6)殘基側(cè)鏈的β-(1→3)-D葡萄糖,與其他多糖相比其分歧程度較低,具有三股螺旋結(jié)構(gòu),認(rèn)為其活性與其三股螺旋結(jié)構(gòu)、離子基團(tuán)及負(fù)電荷的密度有關(guān)。從赤芝中分離得到一個(gè)水溶性抗腫瘤多糖GL-1,由葡萄糖、木糖=阿拉伯糖組成,該多糖具有抗S180腫瘤細(xì)胞的作用,還分離得到抗衰老多糖GLA、GLB、GLC等;Saito等從靈芝子實(shí)體堿性提取物中分得的GLP,由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖L-巖藻糖、L-鼠李糖、L阿拉伯糖等組成;GLP的化學(xué)結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象有明確細(xì)致的顯示。黎鐵立等從泰山赤芝(ganodermalucidumkarst)中分離得到7個(gè)多糖肽,其中二個(gè)為T(mén)GLP-2和TGLP-3。TGLP-2的Mr為2.09×105,為β-(1→3)(1→4)苷鍵連接的甘露葡聚糖肽,含肽量為8.9%。TGLP-3的Mr為405000,為β-(1→3)(1→4)(1→6)苷鍵連接的葡聚糖肽,且有α-苷鍵存在,含肽量為4%。1.2glp的活性自20世紀(jì)70年代以來(lái),國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者均重視靈芝的抗腫瘤作用。Miyazaki等從靈芝子實(shí)體中分離出一種Mr為40000的水溶性多糖(GL-1),其單糖組成及為葡萄糖:木糖、阿拉伯糖,小鼠腹腔注射共10d,發(fā)現(xiàn)有抑制S-180肉瘤的作用。李旭生等從靈芝子實(shí)體中提取的GLP肽對(duì)C3H小鼠的惡性腫瘤有抑制作用,抑制率為55.5%。林志彬等采用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和分子生物學(xué)技術(shù),將GLP進(jìn)行昆明小鼠灌胃亦可顯著抑制BALB/c皮下移植的S-180肉瘤生長(zhǎng),其抑制率為52.86%。可見(jiàn),GLP對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤具有抑制作用,可使瘤重減輕,生存時(shí)間延長(zhǎng)。靈芝所含多糖是其抗腫瘤作用的重要組成部分。Wang等報(bào)告中靈芝子實(shí)體提取的一種GLP能抑制HL-60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。但張群毫等發(fā)現(xiàn)靈芝提取物對(duì)S-180細(xì)胞的增殖無(wú)直接抑制作用。同樣,將靈芝提取物的GLP直接加入到培養(yǎng)液中,對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)也無(wú)直接抑制作用。林志彬也發(fā)現(xiàn)靈芝提取物不能直接誘導(dǎo)S-180細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明,靈芝其所含多糖既不能直接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞,也不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探討GLP的抗腫瘤作用機(jī)制,將GLPB加入到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中,共同培養(yǎng)24h,然后加入HL-60細(xì)胞中,可顯著抑制HL-60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。這一結(jié)果顯示,在GLPB作用下,GLP中出現(xiàn)一種能抑制HL-60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的活性物質(zhì)。與此同時(shí),上清液中TNF-α的分泌亦明顯增加。這些結(jié)果與Wang等所研究的結(jié)果是一致的,他們?cè)贖L-60細(xì)胞和V937細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PS-G與人外周血單個(gè)核細(xì)胞共同培養(yǎng)液則可顯著抑制HL-60細(xì)胞和V937細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡;同時(shí)還證明,在健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PS-G的共同培養(yǎng)上清液可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞生成IL-1β、TNF和IL-6,并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞生成IFN-γ等。GLP并不是直接殺死腫瘤細(xì)胞,而是通過(guò)介導(dǎo)加強(qiáng)宿主免疫功能而激活機(jī)體內(nèi)各種免疫應(yīng)答,進(jìn)而產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞作用。但GLP的抗癌構(gòu)效關(guān)系和抗癌機(jī)制仍不明了,現(xiàn)有的研究表明,GLP大多是β-(1→3)-D-葡聚糖.β-葡聚糖中分支度不同,均具有較高的抗癌活性,Mr大的也較Mr小的活性強(qiáng);由于GLPMr大,不能透過(guò)半透膜,不能直接進(jìn)入靶細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制效果。新近的一些研究發(fā)現(xiàn),含有其他結(jié)構(gòu)的GLP和某些小分子量的也具有免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性。2結(jié)合精細(xì)分子質(zhì)量和納米活性物質(zhì)的機(jī)制2.1減少集合淋巴管“節(jié)流”的活性病理?xiàng)l件下,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移時(shí),病變細(xì)胞釋放的化學(xué)物質(zhì)和腫瘤衍生的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(parathyroidhormone-relatedpeptide,PTHrP)均通過(guò)產(chǎn)生NO和激活KATP來(lái)降低集合淋巴管“節(jié)律泵”的活性,從而影響了淋巴的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)。這提示我們,病理?xiàng)l件下,淋巴回流入血速率減小,藥物靶向于腫瘤的淋巴系統(tǒng)有利于延長(zhǎng)駐留時(shí)間,提高藥效。毛細(xì)淋巴管由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成,其基底膜不完整或缺乏,因而通透性大,存在著淋巴引流的通道,大小約30~120nm,在癌細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)可進(jìn)一步擴(kuò)大為300~500nm。這一通道允許大分子或大小適合的膠束隨著擴(kuò)散而被淋巴引流帶入,并在流經(jīng)淋巴結(jié)時(shí)被巨噬細(xì)胞捕獲;納米活性載體是通過(guò)這樣的過(guò)程實(shí)現(xiàn)淋巴腫瘤靶向的。2.2glp納米活性GLP納米活性載體具有淋巴趨向性,毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間有1203nm的開(kāi)放間隙,但管壁沒(méi)有周細(xì)胞,也沒(méi)有連續(xù)的基膜。納米微粒在藥劑學(xué)中的尺寸界定在10~1000nm,這樣的納米微?？杀痪奘杉?xì)胞攝取。這些細(xì)胞多存在于血流豐富的肝臟、肺臟、脾臟及淋巴結(jié)、腸、骨髓、腦、結(jié)締組織和漿膜腔等。將大MrGLP改造成納米微粒具有高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、較為清晰的核殼相分離,疏水鏈段之間由于疏水相互作用而聚集形成微粒的內(nèi)核,外殼則由親水鏈段形成刷狀結(jié)構(gòu)。這樣親水鏈段通常具有生物相容性并對(duì)納米微粒分散在水中起立體穩(wěn)定作用,在親水鏈段末端還可引入具有靶向功能的組分。當(dāng)GLP納米微粒用于給藥載體時(shí),其特點(diǎn)是內(nèi)核載藥量大,在人體內(nèi)分布主要由顆粒大小和顆粒表面活性劑相比,GLP納米微粒的臨界膠束濃度很低,在水溶液中離解速度慢,因此納米活性可在載體內(nèi)停留較長(zhǎng)時(shí)間,保證有足夠的GLP納米活性微粒到達(dá)人體病灶部位。這些特性給藥輸送帶來(lái)了方便,納米活性微粒可通過(guò)物理的非化學(xué)鏈作用溶解進(jìn)膠束或化學(xué)鏈合進(jìn)膠束,同時(shí)還可以使納米活性微粒具有靶向作用。如孫嵐等采用納米活性炭對(duì)小鼠腹腔注射,研究了體內(nèi)的分布、存留,腹腔內(nèi)淋巴靶向性十分明顯。這可以是由于活性炭被制備成納米微粒后,表面結(jié)合和化學(xué)活性能有顯著增高。多糖類(lèi)的殼聚糖作為與一種天然的可生物降解的高分子材料,在納米微粒腫瘤靶向給藥中也有報(bào)道;將其制成納米粒粒徑在200~750nm時(shí),包封了DNA的殼聚糖有效被腸上皮的M細(xì)胞攝取,并最終又到了血清產(chǎn)生IgA達(dá)到免疫效果,有效誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、抑制腫瘤生長(zhǎng)。3glp納米活性的組織間隙給藥納米活性載體根據(jù)不同的給藥方式,可能的機(jī)制主要運(yùn)用如下:(1)GLP納米活性的消化道給藥:將大分子GLP(數(shù)千~數(shù)十萬(wàn)不等)改造成(300±50)納米的微粒后。經(jīng)口服時(shí)通過(guò)小腸上皮細(xì)胞中的甘油硬脂酸通路,以乳糜微粒的形式靶向于腸系膜淋巴結(jié)。近年來(lái),納米載體促進(jìn)藥物的消化道吸收屢見(jiàn)報(bào)道,在人和動(dòng)物的小腸存在著與免疫有關(guān)的特定組織區(qū)域。如集合淋巴小結(jié)占整個(gè)腸道黏膜的1/4左右。研究發(fā)現(xiàn),口服給藥時(shí),微粒劑可透過(guò)小腸上皮細(xì)胞,經(jīng)過(guò)集合淋巴小結(jié)到達(dá)脾臟等淋巴系統(tǒng)器官,且粒度越小,吸收效果越好。(2)GLP納米活性的組織間隙給藥:GLP改造后,當(dāng)載藥納米微粒進(jìn)行皮下、肌內(nèi)、癌周等組織間隙給藥時(shí),納米微粒同時(shí)面臨著毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取。其以何種途徑為主則取決于載藥粒子的性質(zhì),如粒徑、表面電性等而定。正如前述,由于內(nèi)皮細(xì)胞間連接松散,常駐有許多開(kāi)放的間隙存在,微粒和大分子物質(zhì)可通過(guò)毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間間隙和內(nèi)皮細(xì)胞的胞飲及吞噬作用進(jìn)入毛細(xì)淋巴管內(nèi),然后通過(guò)淋巴引流到達(dá)區(qū)域淋巴結(jié)。微粒和大分子物質(zhì)的大小大部分在進(jìn)入到毛細(xì)血管內(nèi)時(shí),數(shù)百納米內(nèi)的粒子則可被毛細(xì)淋巴管吸收,而數(shù)千的粒子則會(huì)長(zhǎng)時(shí)間滯留在組織間隙的空間里。因此大分子質(zhì)量物質(zhì)常常就不直接進(jìn)入靶細(xì)胞,而是首先與分布在靶細(xì)胞表面的特異性受體或者配體結(jié)合,通過(guò)某些特定的信號(hào)通路,產(chǎn)生最終的生理效應(yīng)。4glp納米活性的靶向給藥GLP納米活性的淋巴系統(tǒng)給藥是以乳劑為載體,該劑型具有淋巴親和性的特點(diǎn)。局部注射乳劑后,可以聚集在區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi),并有緩釋藥物的功能。另有一些方式是針對(duì)消化道給藥的納米活性載體。一般認(rèn)為,油/水(O/W)型的靶向性要優(yōu)于水/油(W/O)型,復(fù)乳優(yōu)于單乳,乳劑的穩(wěn)定性是影響淋巴攝取的一大因素。(1)GLP納米活性有藥效延長(zhǎng)時(shí)間作用:GLP納米微粒具有包含疏水性物質(zhì)作內(nèi)核制成的膠束。一般植物為疏水性物質(zhì)或半合成的中長(zhǎng)鏈脂肪酸的甘油酯(如Miglyol或Panasate)。研究表明:有兩種性質(zhì),第一種是局部以納米囊給藥,能經(jīng)過(guò)組織靶向到淋巴結(jié);另一種是局部以納米微乳給藥,是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑等四種體系組成,粒徑在10~500nm間的納米乳劑,靶向淋巴后釋藥更為持久(可維持恒量水平達(dá)7d,遠(yuǎn)大于參比的乳液和脂質(zhì)體)。由于其處方中親脂性成分比例大,與淋巴具有一定的親和性,加之粒徑小、比表面積大,在淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)幾乎沒(méi)有障礙,也已被研究用以靶向淋巴腫瘤上。(2)GLP納米活性對(duì)抑制腫瘤靶向性:GLP納米微粒是指納米尺度范圍的膠束,纖維素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象使其微溶于水和常用的藥用有機(jī)溶劑,而對(duì)于納米微粒的制備,在常用溶劑中有較高溶解度是必需的;由于自身的特點(diǎn),這一類(lèi)給藥方式就是靶向給藥。纖維素分子中存在大量羥基,可發(fā)生加成、取代、氧化等反應(yīng),從而得到其可溶性衍生物。王學(xué)清等采用羥丙甲纖維素酞酸以溶劑-非溶劑法制備環(huán)孢素A納米微粒,注射入大鼠時(shí)相對(duì)提高生物利用度。如殼聚糖-多柔比星(DOX)納米微?？砂喈?dāng)含量的DOX,該微粒稀釋較少,保持了DOX的細(xì)胞毒活性。共聚焦成像表明該微粒是通過(guò)胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并在胞內(nèi)釋放DOX。進(jìn)一步的研究表明:用微乳法制得的殼聚糖DOX/葡聚糖納米微粒,粒徑為(100±10)nm,可較好地透過(guò)實(shí)體瘤并保留其內(nèi),同時(shí)明顯降低副作用并提高療效。5glp的應(yīng)用將高M(jìn)rGLP改造成(300±50)nm以下的低MrGLP(多肽)抗腫瘤制劑,該微粒具有優(yōu)于原始分子的靶向性;納米微粒給藥機(jī)制相比于載體材料具有生物利用度與提高難溶