第三章 DNA的復(fù)制

第三章DNA復(fù)制(DNAReplication)

3.1復(fù)制的機(jī)理3.2復(fù)制的過程3.3復(fù)制的酶學(xué)3.4復(fù)制的形式3.5復(fù)制的調(diào)控

定義：親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基互補配對的游離的dNTP,合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程。

3.1DNA復(fù)制的基本機(jī)理

DNA由兩條螺旋的多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基通過A:T和G:C之間的氫鍵聯(lián)結(jié)在一起。在復(fù)制過程中首先兩條鏈間的氫鍵破裂并使雙鏈解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按堿基互補配對原則(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互補鏈，結(jié)果由一條鏈成為互補的兩條鏈，這樣新形成的兩個DNA分子與原來的DNA分子的堿基序列完全相同。在此過程中，每個子代DNA的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制(semiconservativereplication)。

1958年Meselson和Stahl的實驗首次有力地支持了半保留復(fù)制方式。他們先將大腸桿菌放在15NH4C1培養(yǎng)基中生長15代，使幾乎所有的DNA都被15N標(biāo)記后，再將細(xì)菌移到只含有14NH4C1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，在不同的時間取出樣品，用十二烷硫酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞后，將裂解液放在CsC1溶液中進(jìn)行密度梯度離心(140000g，20小時)。離心結(jié)束后，從管底到管口，溶液密度分布從高到低形成密度梯度。DNA分子就停留在與其相當(dāng)?shù)腃sC12密度處，在紫外光下可以看到形成的區(qū)帶。14N-DNA分子密度較輕(1.7g/cm3)，停留在離管口這較近的位置;15N-DNA密度較大停留在較低的位置上。

當(dāng)含有15N-DNA的細(xì)胞在14NH4C1培養(yǎng)液中培養(yǎng)一代后，只有一條區(qū)帶介于14N-DNA與15N-DNA之間，這時在15N-DNA區(qū)已沒有吸收帶，說明這時的DNA一條鏈來自15N-DNA，另一條鏈為新合成的含有14N的新鏈。培養(yǎng)兩代后則在14N-DNA區(qū)又出現(xiàn)一條帶。在14NH4C1中培養(yǎng)的時間愈久，14N-DNA區(qū)帶愈強(qiáng)，而14N-15NDNA區(qū)帶逐漸減弱，但始終未出現(xiàn)其他新的區(qū)帶。按照半保留復(fù)制方式培養(yǎng)兩代，只能出現(xiàn)14N-15NDNA兩種分子，而且隨著代數(shù)的增加14N-DNA逐漸增加。Meselson和Stahl的實驗完全證實了保留復(fù)制的設(shè)想。

Meselson等證明DNA的半保留復(fù)制

中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所2002年招收碩士研究生分子遺傳學(xué)入學(xué)考試：請設(shè)計一個實驗來證明DNA復(fù)制是以半保留方式進(jìn)行的（8分）。復(fù)制起點和復(fù)制子

DNA復(fù)制在生物細(xì)胞中要從DNA分子上特定位置開始。這個特定的位置就稱為復(fù)制起點(Originofreplication)，用ori表示。DNA復(fù)制從起點開始雙向進(jìn)行直到終點為止，每一個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。

在原核生物中，每個DNA分子上通常只有一個復(fù)制子而在真核生物中，每個DNA分子有許多個復(fù)制子(多復(fù)制起點），每個復(fù)制子長約50-200kb。因此，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制是由許多個復(fù)制子共同完成的

DNA復(fù)制不是隨機(jī)的從DNA分子上的任何一點起始，而是從特定的區(qū)域開始，這說明復(fù)制起點有其結(jié)構(gòu)上的特殊性。如科學(xué)家們利用分子克隆技術(shù)，分離出大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起點oriC，發(fā)現(xiàn)其含有3個13bp的串聯(lián)重復(fù)保守序列和4個9bp的保守序列。

DNA復(fù)制的特點

DNA復(fù)制的最主要特點是半保留復(fù)制另外，它還是半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)。

半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此，在?fù)制起點處兩條DNA鏈解開成單鏈時，一條是5'→3'方向，另一條是3'→5'方向。以這兩條鏈為模板時，新生鏈延伸方向一條為3'→5'，另一條為5'→3'。但生物細(xì)胞內(nèi)所有DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，這是一個矛盾。岡崎片段(Okazakifragments)的發(fā)現(xiàn)使這個矛盾得以解決。

在復(fù)制起點兩條鏈解開形成復(fù)制泡(replicationbubbles)，DNA向兩側(cè)復(fù)制形成兩個復(fù)制叉(replicationforks)。以復(fù)制叉移動的方向為基準(zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?'→5'，以此為模板而進(jìn)行的新生DNA鏈的合成沿5'→3'方向連續(xù)進(jìn)行，這條鏈稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。另一條模板鏈的方向為5'→'3'，以此為模板的DNA合成也是沿5'→3'方向進(jìn)行，但與復(fù)制叉前進(jìn)的方向相反，而且是分段，不連續(xù)合成的，這條鏈稱為滯后鏈(laggingstrand)，合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。

AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kbDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）Okazakifragment1968ReijiOkazaki

復(fù)制的多模式

單起點、單方向多起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向3.2DNA復(fù)制的過程DNA復(fù)制過程大致可以分為復(fù)制的引發(fā)，DNA鏈的延伸和DNA復(fù)制的終止三個階段。(一)DNA復(fù)制的引發(fā)

復(fù)制的引發(fā)(Priming)階段包括DNA復(fù)制起點雙鏈解開，通過轉(zhuǎn)錄激活步驟合成RNA分子（RNA引物的合成），DNA聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到引物RNA的3‘-OH末端。復(fù)制引發(fā)的關(guān)鍵步驟就是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，滯后鏈上的DNA合成也隨著開始，在所有前導(dǎo)鏈開始聚合之前有一必需的步驟就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滯后鏈模板轉(zhuǎn)錄一短的RNA分子。

在有些DNA復(fù)制中，(如質(zhì)粒ColE)，該RNA分子經(jīng)過加工成為DNA復(fù)制的引物。但是，在大部分DNA復(fù)制中，該RNA分子沒有引物作用。它的作用似乎只是分開兩條DNA鏈，暴露出某些特定序列以便引發(fā)體與之結(jié)合，在前導(dǎo)鏈模板DNA上開始合成RNA引物，這個過程稱為轉(zhuǎn)錄激活(transcriptionalactivation)，在前導(dǎo)鏈的復(fù)制引發(fā)過程中還需要其他一些蛋白質(zhì)，如大腸桿菌的dnaA蛋白。

這種蛋白質(zhì)（dnaA蛋白）可以和復(fù)制起點處DNA上高度保守的4個9bp長的序列結(jié)合，其具體功能尚不清楚?？赡苁沁@些蛋白質(zhì)與DNA復(fù)制起點結(jié)合后能促進(jìn)DNA聚合酶Ⅲ復(fù)合體的七種蛋白質(zhì)在復(fù)制起點處裝配成有功能的全酶。

DNA復(fù)制開始時，DNA螺旋酶首先在復(fù)制起點處將雙鏈DNA解開，通過轉(zhuǎn)錄激活合成的RNA分子也起分離兩條DNA鏈的作用，然后單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSBP)結(jié)合在被解開的鏈上。

由復(fù)制因子X(n蛋白)，復(fù)制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6種蛋白質(zhì)組成的引發(fā)前體(preprimosome)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的作用下與單鏈DNA結(jié)合生成中間物，這是一種前引發(fā)過程。

引發(fā)前體進(jìn)一步與引物酶(primase)或引發(fā)酶組裝成引發(fā)體(primosome)。引發(fā)體可以在單鏈DNA上移動，在dnaB亞基的作用下識別DNA復(fù)制起點位置。首先在前導(dǎo)鏈上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引發(fā)體在滯后鏈上沿5'→3'方向不停的移動(這是一種相對移動，也可能是滯后鏈模板在移動，)，在一定距離上反復(fù)合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成岡崎片段使用，引發(fā)體中許多蛋白因子的功能尚不清楚。

但是，這些成份必須協(xié)同工作才能使引發(fā)體在滯后鏈上移動，識別合適的引物合成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物。

由于引發(fā)體在滯后鏈模板上的移動方向與其合成引物的方向相反，所以在滯后鏈上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5個核苷酸長。而且，在同一種生物體細(xì)胞中這些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。

為什么需要有RNA引物來引發(fā)DNA復(fù)制呢?這可能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNA復(fù)制開始處的幾個核苷酸最容易出現(xiàn)差錯，因此，用RNA引物即使出現(xiàn)差錯最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進(jìn)入DNA鏈的延伸階段。

(二)DNA鏈的延伸

DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必須由螺旋酶在復(fù)制叉處邊移動邊解開雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種拓?fù)鋵W(xué)上的問題:由于DNA的解鏈，在DNA雙鏈區(qū)勢必產(chǎn)生正超螺旋，在環(huán)狀DNA中更為明顯，當(dāng)達(dá)到一定程度后就會造成復(fù)制叉難再繼續(xù)前進(jìn)，從而終止DNA復(fù)制。

但是，在細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制不會因出現(xiàn)拓?fù)鋵W(xué)問題而停止。有兩種機(jī)制可以防止這種現(xiàn)象發(fā)生:(1)DNA在生物細(xì)胞中本身就是超螺旋，當(dāng)DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋時，可以被原來存在的負(fù)超螺旋所中和;(2)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ要以打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀態(tài)，而DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(旋轉(zhuǎn)酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續(xù)將負(fù)超螺旋引入雙鏈DNA。

這兩種機(jī)制保證了無論是環(huán)狀DNA還是開環(huán)DNA的復(fù)制順利的解鏈，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA鏈。

DNA生長鏈的延伸主要由DNA聚合酶Ⅲ催化，該酶是由7種蛋白質(zhì)(多肽)組成的聚合體，稱為全酶。全酶中所有亞基對完成DNA復(fù)制都是必需的。α亞基具有聚合功能和5'→3'外切酶活性，ε亞基具有3'→5'外切酶活性。另外，全酶中還有ATP分子,它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一個脫氧核糖核苷酸連接在RNA引物上所必需的，其他亞基的功能尚不清楚。

在DNA復(fù)制叉處要能由兩套DNA聚合酶Ⅲ在同一時間分別進(jìn)行DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈復(fù)制。如果滯后鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，則滯后鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上進(jìn)行。

這樣，當(dāng)DNA聚合酶Ⅲ沿著滯后鏈模板移動時，由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。當(dāng)合成的DNA鏈到達(dá)前一次合成的岡崎片段的位置時，滯后鏈模板及剛合成的岡崎片斷便從DNA聚合酶Ⅲ上釋放出來。

這時，由于復(fù)制叉繼續(xù)向前運動，便產(chǎn)生了又一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA聚合酶Ⅲ開始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過這樣的機(jī)制，前導(dǎo)鏈的合成不會超過滯后鏈太多(最后只有一個岡崎片段的長度)。而且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移動。

按上述DNA復(fù)制的機(jī)制，在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體(復(fù)制體replisome

：復(fù)制叉上DNA模板以特定的結(jié)構(gòu)與酶和蛋白質(zhì)偶聯(lián)成的核蛋白復(fù)合物)。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模板上移動時便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。

在DNA合成延伸過程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。當(dāng)岡崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通過其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，同時，利用后一個岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個岡崎片段由DNA連接酶將其接起來，形成完整的DNA滯后鏈。(三)DNA復(fù)制的終止

過去認(rèn)為，DNA一旦復(fù)制開始，就會將該DNA分子全部復(fù)制完畢，才終止其DNA復(fù)制。但最近的實驗表明，在DNA上也存在著復(fù)制終止位點，DNA復(fù)制將在復(fù)制終止位點處終止，并不一定等全部DNA合成完畢。

目前對復(fù)制終止位點的結(jié)構(gòu)和功能了解甚少,在DNA復(fù)制終止階段令人困惑的一個問題是，線性DNA分子兩端是如何完成其復(fù)制的?

已知DNA復(fù)制都要有RNA引物參與。當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在線性分子的兩端以5'→3'為模板的滯后鏈的合成，其末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的。

在研究T7DNA復(fù)制時，這個問題部分地得到了解決。T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長的序列完全相同。而且，在T7DNA復(fù)制時，產(chǎn)生的子代DNA分子不是一個單位T7DNA長度，而是許多單位長度的T7DNA首尾連接在一起。T7DNA兩個子代DNA分子都會有一個3'端單鏈尾巴，兩個子代DNA的3'端尾巴以互補結(jié)合形成兩個單位T7DNA的線性連接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA連接酶連接后，繼續(xù)復(fù)制便形成四個單位長度的T7DNA分子。這樣復(fù)制下去，便可形成多個單位長度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可以被特異的內(nèi)切酶切開，用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。

在研究痘病毒復(fù)制時，發(fā)現(xiàn)了線性DNA分子完成末端復(fù)制的第二種方式。痘病毒DNA在兩端都形成發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)。DNA復(fù)制時，在線性分子中間的一個復(fù)制起點開始，雙向進(jìn)行，將發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)變成雙鏈環(huán)狀DNA。然后，在發(fā)夾的中央將不同DNA鏈切開，使DNA分子變性，雙鏈分開。這樣，在每個分子兩端形成一個單鏈尾端要以自我互補，形成完整的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與親代DNA分子一樣。

在真核生物染色體線性DNA分子復(fù)制時，尚不清楚末端的復(fù)制過程是怎樣進(jìn)行的。也可能像痘病毒那樣形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而進(jìn)行復(fù)制。

但最近的實驗表明，真核生物染色體末端DNA復(fù)制是由一種特殊的酶將一個新的末端DNA序列加在剛剛完成復(fù)制的DNA末端。這種機(jī)制首先在四膜蟲中發(fā)現(xiàn)。該生物細(xì)胞的線性DNA分子末端有30-70拷貝的5'TTGGGG3'序列，該細(xì)胞中存在一種酶可以將TTGGGG序列加在事先已存在的單鍵DNA末端的TTGGGG序列上。這樣有較長的末端單鏈DNA，可以被引物酶重新引發(fā)或其他的酶蛋白引發(fā)而合成RNA引物，并由DNA聚合酶將其變成雙鏈DNA。這樣就可以避免其DNA隨著復(fù)制的不斷進(jìn)行而逐漸變短。

在環(huán)狀DNA的復(fù)制的末端終止階段則不存在上述問題。環(huán)狀DNA復(fù)制到最后，由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切開雙鏈DNA，將兩個DNA分子分開成為兩個完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。

3.3與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)

3.3.1DNA復(fù)制的復(fù)雜性

①復(fù)制過程解鏈需要能量供應(yīng)②如何維持單鏈過程③DNA復(fù)制要求高度真實④超螺旋的問題⑤不同生物復(fù)制機(jī)制不同⑥線性DNA復(fù)制過程如何解決最后一個引物是怎樣切除的3.3.2原核生物DNA復(fù)制的酶學(xué)

3.3.2.1DNA聚合酶

3.3.2.2引物酶和RNA聚合酶

3.3.2.3解螺旋酶

3.3.2.4單鏈結(jié)合蛋白（SSBP）

3.3.2.5依賴于DNA的ATP酶

3.3.2.6DNA連接酶

3.3.2.7旋轉(zhuǎn)酶

3.3.2.1DNA聚合酶以E.coliDNA聚合酶為例:（1）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)（2）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：（3）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)：

性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生鏈合成--+主要是對DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。修復(fù)紫外光引起的DNA損傷DNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3’-5‘外切酶的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）

㈠DNA聚合酶Ⅰ

主要負(fù)責(zé)DNA損傷的