高效液相色譜分析方法的建立

1.反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析方法的建立

2.液相色譜常見問題及處理方法

3.色譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）

4.制備液相色譜技術(shù)反相高效液相色譜（RP-HPLC）

分析方法的建立什么是色譜？色譜是一種建立在一定的科學(xué)理論基礎(chǔ)上的分離方法（工具、手段）。除色譜之外，經(jīng)典（常見）的分離方法：蒸餾、離心、電泳、過濾、沉淀、萃取等等色譜是一種高效能的分離方法色譜分析以一定的科學(xué)理論為基礎(chǔ)，在高效能的分離基礎(chǔ)上，結(jié)合先進的檢測方法而建立的現(xiàn)代分析方法。什么是高效液相色譜法？HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于現(xiàn)代儀器方法的高效能分析方法：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度、高選擇性的檢測器……廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……在技術(shù)、理論及應(yīng)用上已進入一個較高的水平，并高速發(fā)展。HPLC的基本配置及流程溶劑

色譜泵手動/自動進樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

HPLC的儀器配置泵系統(tǒng)自動進樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑色譜的發(fā)明人-——茨維特（M.S.Tswett）

俄國科學(xué)家茨維特1903年利用物質(zhì)的吸附原理，開創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。1906年正式命名色譜法；Chromatography30年代開始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代色譜的發(fā)明人俄國科學(xué)家

M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻中的一段話一般情況下HPLC不是分析方法的首選

分析方法選擇的大致程序（以藥典分析方法為例）：

滴定分析（原料藥、制劑定量分析）紫外可見光度分析（原料藥、制劑定量分析）薄層色譜（鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢查等；半定量分析）

HPLC（中藥飲片、中藥制劑的鑒別或有關(guān)物質(zhì)的檢查；復(fù)雜樣品定量分析等）什么情況下使用HPLC？什么情況下使用HPLC？1、對分析結(jié)果、測定速度和效率的要求準確度要求：準確定量（RSD<5％）測定速度和效率：快速，單一或多組分測定。2、樣品情況樣品的復(fù)雜情況：HPLC適用于復(fù)雜樣品的分析，如中藥分析、環(huán)境分析、體內(nèi)藥物分析、臨床藥物分析等。HPLC方法建立的前期工作

樣品情況的了解：樣品的種類（來源）：植物（中草藥）、合成中間體、生物樣品（血液、尿液、組織勻漿等）……

樣品的種類決定了樣品的復(fù)雜程度（基質(zhì)影響），從而可初步判定測定的難易程度并且為分析方法的確立設(shè)計一個大致的方向。待測成分的性質(zhì)：極性、水溶性、脂溶性、酸堿性等對方法的建立，有重要的指導(dǎo)意義。待測成分的結(jié)構(gòu)特征：對色譜柱的選擇具有一定的指導(dǎo)意義（不是很明顯）；對檢測器的選擇具有指導(dǎo)意義，如：含有生色團（助色團），紫外有吸收，特別是芳香族化合物，可考慮使用紫外檢測器待測成分的含量：

決定對柱效的要求（柱效高，可有較低的檢測限）決定對檢測器靈敏度的要求樣品情況的了解：測定成分的數(shù)量以及性質(zhì)相似程度：單一成分的測定，最簡單，隨著測定成分的增加，分析的難度增加；組分性質(zhì)的相似程度越高，分析的難度越高。樣品情況的了解：問題：組分性質(zhì)的相差越大，分析的難度越低，是否越有利于多組分分析？查閱有關(guān)的文獻資料文獻資料——有：在文獻的基礎(chǔ)上，調(diào)整、改善。不排除在文獻基礎(chǔ)上全面創(chuàng)新。文獻查閱時應(yīng)注意的基本內(nèi)容液相色譜實驗所需的基本參數(shù)樣品預(yù)處理方案對照品（標準品）的配制方法流動相：種類及配比，等度或梯度？固定相：色譜柱類型、顆粒大小及內(nèi)徑、長短流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器及相應(yīng)參數(shù)：如紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個具體的HPLC方法；亦稱色譜分析條件。查閱有關(guān)的文獻資料文獻資料——無：結(jié)合樣品的情況，首先應(yīng)作一些試探性的工作。（見后面）評價高效液相色譜方法的標準問題：什么樣的分離結(jié)果是好的？答：用盡可能少的時間和消耗（人力、物力、財力等）滿足分析的要求（準確度、靈敏度、分析速度等）。只有更好，沒有最好！

理論塔板數(shù)n

：分離效率（柱效）的量度理論塔板數(shù)計算公式：評價液相色譜方法的標準理論塔板數(shù)n

：描述組分被保留的程度以及色譜峰譜帶展寬的程度。塔板數(shù)越大，柱效越高。W=.5W=2tR=5tR與W是一對矛盾，tR/W可以很好地表達這對矛盾的情況。

影響柱效的因素很多，可以從色譜理論進行分析，如塔板理論、速率理論等，具體內(nèi)容參見有關(guān)教科書或?qū)Ｖ?。什么是色譜的分離度分離度的公式：R：分離程度的量度簡稱分離度評價液相色譜方法的標準tR1tR2影響分離度的因素：k、α及n分離度方程：

k

是容量因子，表達了被分離組分與柱填料之間作用的強弱

α是分離因子，描述兩個被分離組份容量因子的相對大小。α

＝k2/k1

n是理論塔板數(shù)，描述組分被保留的程度以及色譜峰譜帶展寬的程度分離度是色譜分離中主要考慮的因素除分離度之外，在設(shè)計色譜方法時，以下幾個因素也都要考慮：靈敏度載樣量分析速度溶劑損耗成本容易使用（簡單）色譜柱壽命文獻資料查詢——無根據(jù)評價液相色譜方法的標準，結(jié)合樣品的情況，作一些試探性的工作根據(jù)評價液相色譜方法的標準，

進行試探性工作色譜分析樣品預(yù)處理的主要目的將待測物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，制成便于分析測定的穩(wěn)定液體試樣。如：中草藥或中成藥有效（指標）成分分析；體液中藥物或代謝物含量的測定等。除去雜質(zhì)，純化樣品，防止色譜柱的堵塞。如生物樣品中的蛋白質(zhì)、葉綠素、固體微粒等。富集濃縮樣品或進行衍生化，以達到色譜分析的檢測限。一、根據(jù)了解的樣品信息以及分析目的，建立樣品預(yù)處理方案進行樣品預(yù)處理的必要性

樣品只有成為液體狀態(tài)才能直接進行HPLC分析。雖然色譜分析具有很強的處理復(fù)雜樣品的能力，但樣品如果過于復(fù)雜（如中藥飲片、中成藥、生物樣品分析等），若不進行必要的預(yù)處理，則會影響到分析的準確性，并且可能導(dǎo)致測定失敗。任何先進的色譜技術(shù)都須有先進的樣品處理技術(shù)相匹配，樣品處理技術(shù)的適當與否，直接關(guān)系到色譜分析的成本、速度和實用性。樣品預(yù)處理的種類物理的分離與濃縮技術(shù)

過濾、沉淀分離、吸附、蒸餾、溶劑的揮發(fā)溶劑萃取回流、索氏提取、超聲波提取固相萃?。⊿PE）

吸附劑（硅膠、氧化鋁）、高分子大孔樹脂（苯乙烯－二乙烯苯）、離子交換樹脂、鍵合硅膠等超臨界流體萃取化學(xué)衍生化技術(shù)HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)，并有一個輸出信號檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間在一定的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系二、選擇檢測器、確定使用條件HPLC檢測器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（Solutepropertydetectors）對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反映流動相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）

沒有任何一種單獨的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！不同種類的檢測器的分類整體性質(zhì)示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器電導(dǎo)檢測器溶質(zhì)性質(zhì)熒光檢測器固定波長可變波長光電二極管矩陣電化學(xué)檢測器放射化學(xué)檢測器氮/硫檢測器質(zhì)譜檢測器紫外/可見光檢測器理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略基線噪音（信噪比高）寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對流動相的壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性（可降低分析組分色譜分離的壓力）檢測器的靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10高的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更準確的定量更好地完成色譜峰純度的確認 （較低的閾值）6:1NS常用液相色譜的檢測器常規(guī)檢測器示差折光檢測器（RefractiveIndex）紫外/可見光吸收檢測器（UV-Vis）熒光檢測器（Fluorescence）蒸發(fā)光散射檢測器（EvaporativeLightScattering）其他檢測器（OtherDetectors）高端檢測器光電二極管矩陣檢測器（PhotodiodeArrayPDA）質(zhì)譜檢測器（MassSpectrometry）選擇液相色譜的檢測器要考慮的因素：

你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動相的影響溶劑、緩沖鹽、改性劑等梯度還是等度（梯度不適于整體性質(zhì)檢測器）準確度要求靈敏度需求是否有雙檢測的需求HPLC檢測器的選擇：通用檢測器 RIELSD MS靈敏度 mg ng pg 線性范圍 104

否 103流速敏感 是 否 是溫度敏感 是 是 是破壞性 否 是 是選擇性檢測器UV/Vis

FL EC MS靈敏度 ng pg fg pg線性范圍 105 103 106 103流速敏感 否 否 是 是溫度敏感 否 否 是 是破壞性 否 否 是 是UV/Vis檢測器目前實驗室中最流行的選擇約75%的HPLC檢測器配備的是UV/Vis（其中50%是可變波長，25%是PDA）吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大UV/Vis的優(yōu)點簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm對羥基苯甲酸酯類色譜圖UV/Vis的缺點由于不是所有化合物都有紫外可見吸收，因此不是通用檢測器（有時也是優(yōu)點）對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑（抑制拖尾）也會有影響背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動相有背景紫外吸收實際濃度理想10吸光度210背景吸收熒光（Fluorescence）檢測器發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光。基態(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動能（2）發(fā)射（3）1.分子在吸收UV或可見光后進入激發(fā)態(tài)，分子達到不穩(wěn)定的高能量狀態(tài)。2.電子失去過剩的能量成為振動能，并達到最低的激發(fā)單重態(tài)。3.電子失去能量達到基態(tài)時發(fā)出熒光共軛及芳香族化合物最容易有熒光現(xiàn)象熒光檢測器原理熒光檢測器的應(yīng)用環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素熒光檢測器的優(yōu)點選擇性提高靈敏度提高（在pg/fg范圍）低背景技術(shù)mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation

=280Emission=360熒光檢測器的缺點不是所有化合物都有熒光，需要衍生；檢測器對溶解氣體及其他淬滅物質(zhì)（如甲醇）敏感；Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響；多數(shù)儀器的批次間差異較大，同一型號的不同熒光檢測器會得到不同的結(jié)果。溶劑中溶解的氣體對響應(yīng)值的影響實例MinutesColumn-PAHColumn@27oCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脫氣未充分脫氣FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb蒸發(fā)光散射（EvaporativeLightScattering）檢測器用氮氣把流動相吹成細霧狀液滴；流動相的液滴通過一個預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉；蒸發(fā)的溶劑被除去；溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束并與入射光相交，產(chǎn)生散射；散射光在光電倍增管（PMT）上產(chǎn)生信號；PMT的輸出與溶質(zhì)的量呈比

例關(guān)系蒸發(fā)光散射檢測器原理示意圖EvaporativeLightScatterin