第三章 基因克隆的載體

基因工程華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳明清《基因工程原理》第一章導(dǎo)論第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的載體第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表達(dá)第六章基因工程的基本技術(shù)第三章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第四節(jié)人工染色體載體（B/Y/HAC）引言基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實(shí)現(xiàn)。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)；具有1-2個選擇標(biāo)記基因，如對抗生素的抗性基因等；具備多克隆位點(diǎn)（MCS），而且可攜帶外源DNA片段的長度范圍較寬。自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene第三章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第四節(jié)人工染色體載體（B/Y/HAC）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）1、質(zhì)粒的生物學(xué)特性2、質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹1.質(zhì)粒的生物學(xué)特性（1）質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。1.質(zhì)粒的生物學(xué)特性（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。（3）質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復(fù)制，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄主的生存。比如，對抗菌素的抗性，對重金屬的抗性等。1.質(zhì)粒的生物學(xué)特性（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stigentplasmid）,拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）,拷貝數(shù)為10-60。不過，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間也可能有很大的變化。（5）質(zhì)粒的不親和性兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。已鑒別出25個以上大腸桿菌質(zhì)粒的不親和群，它們之間是相容的。1.質(zhì)粒的生物學(xué)特性（6）質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個裂口）線狀雙螺旋（兩個裂口）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL1.質(zhì)粒的生物學(xué)特性

質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性

革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?/p>

接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等

非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定天然質(zhì)粒的局限性天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）1、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性2、質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹質(zhì)粒載體：作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)等部分。多克隆位點(diǎn)：克隆載體中的一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個載體中是唯一的。選擇標(biāo)記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如對氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選自得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。pBR3224363連接加反應(yīng)液TetorAmpTet+AmpCK+2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹（1）PBR322pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因pBR322：（1）元件來源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。①復(fù)制起點(diǎn)

oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點(diǎn)。pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記

插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。③

高拷貝數(shù)②

分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。pBR322的缺點(diǎn)能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！①刪除mob識別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。PBR322的改進(jìn)pBR325：在pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。

cmlr上也帶一個EcoRI位點(diǎn)。使EcoRI也成為插入失活型位點(diǎn)。②

改造EcoRI位點(diǎn)（2）pUCUniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC192.質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹①

復(fù)制起點(diǎn)pBR322的

ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。②

Ampr基因（1）元件來源③lacZ的啟動子大腸桿菌④lacZ’基因大腸桿菌lacZ的

-肽鏈序列，

是LacZ的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因（2）長度約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)10個連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。

-互補(bǔ)

(alpha-complementation)

大腸桿菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的-片段和-片段分開時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ

基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的-片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是alpha-complementation.所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和誘導(dǎo)物IPTG的平板上分辨出來。因?yàn)檫@類菌落中釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別。However,CloningofDNAinsertsintooneoftheuniquesitesinthepolylinkercaninactivatesthelacZgeneandleadstocolourlesscoloniesonX-Gal/IPTGplates,allowingforreadydetectionofcoloniescarryingclonedDNA.（3）pGEM-3Z多拷貝裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹（3）pGEM-3Z

裝有兩個噬菌體的強(qiáng)啟動子用于外源基因的高效表達(dá)T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等表達(dá)型質(zhì)粒載體裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件，主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）

轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件①表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（4）pET

pETvectorsaredesignedtoallowtheexpressionofclonedgenestoproteins.pET-5hasaregionencodinganelevenaminoacidstretchofproteinbeforeEcoRIandBamHIrestrictionsites.Cloningintothesesitesresultsinexpressionoftheclonedinsertasafusionprotein.UseofNdeIenzymeincuttingvectorandinsertallowsexistedcodontobereplacedbytheinitiationcodonoftheinsert,resultinginexpressionoftheinsertwithnofusion.

2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹（4）pBluescriptSK

pBluescriptSKissimilartothepGEMvectorsexceptthatitalsocarriesanoriginofreplicationforafilamentousphage,f1.f1usesasinglestrandedDNAmoleculeasagenomeandpBluescriptKScanbeusedtogeneratessDNA.Ifahostcellcarryingsuchaplasmid,superinfectionwithphagef1leadstoproductionofphagecontainingplasmidDNA.2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹第三章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第四節(jié)人工染色體載體（B/Y/HAC）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）1、噬菌體的生物學(xué)特性2、噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體1.噬菌體的生物學(xué)特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣殼).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.1.噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生長周期可分為溶菌周期和溶源周期兩種類型。前者指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。在溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。只有溶菌生長周期的噬菌體被稱為烈性噬菌體。只有溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體。整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶源性細(xì)菌。在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。1.噬菌體的生物學(xué)特性

Lyticcycle(溶菌周期)ofgrowth:TheinjectedDNAinhostbacteriumreplicatedmanytimes,phagestructuralproteinsareexpressedandthenewphagechromosomesarepackagedintophageheads.Newphagesarethenreleasedbylysis(溶胞)ofthehostcell.1.噬菌體的生物學(xué)特性

Lysogeniccycle

(溶源周期)：Undercertaincircumstances,however,thelambdaDNAinsertsitselfintotheE.colichromosomeandisastablepartofthechromosome.TheLambdaDNAisreplicatedalongWiththeE.colichromosome.Ifthehostcellbecomesdamaged,suchasUVtreatment,theprophageDNAexcisesitselfandundergoeslyticgrowth.l噬菌體生物學(xué)特性：溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)1.噬菌體的生物學(xué)特性

DNA為線狀雙鏈DNA分子，長度為48502bp，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)（cohesiveendsite）.DNA至少包括61個基因，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分可以被外源基因取代而不會影響到噬菌體的正常功能。l噬菌體生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：感染周期體內(nèi)包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）1、噬菌體的生物學(xué)特性2、噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）l-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點(diǎn)和7個HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶切位點(diǎn)l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立