fgf5基因外顯子1序列分析

fgf5基因外顯子1序列分析

對于繁殖動物來說，它們具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。尋找影響毛囊/毛乳頭生長的相關(guān)因子一直是眾多研究的目標(biāo)。目前有關(guān)影響毛囊生長發(fā)育的相關(guān)因子的研究主要集中于人和小鼠,而關(guān)于影響產(chǎn)毛動物(如毛兔)毛囊生長發(fā)育的研究很少,這大大制約了產(chǎn)毛動物育種的發(fā)展。成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)作為影響被毛長度的調(diào)控因子,廣泛存在于各組織中,迄今為止共鑒定出23種FGFs,但是人FGF15和小鼠FGF19尚未被證實(shí)。FGF5是FGF家族中的一員。在鼠中,有70多種基因突變影響被毛形態(tài),許多突變對被毛的長度無影響,有些使被毛變短,到目前為止只有一種突變(最初命名為go基因突變)引起被毛變長,這一突變現(xiàn)象引起了眾多學(xué)者的關(guān)注,研究證明安哥拉鼠是由FGF5突變引起的,以后的一系列試驗(yàn)表明FGF5是影響毛囊周期性活動及被毛生長的很重要的生長因子。進(jìn)一步深入研究證明了兔毛生長發(fā)育過程與毛囊/毛乳頭有著密切的聯(lián)系,而FGF5是唯一通過影響毛囊生長期的長短從而影響被毛的長度的調(diào)控因子。國內(nèi)外對與產(chǎn)毛性狀相關(guān)基因的研究很少,家兔作為經(jīng)濟(jì)動物在分子方面的研究更少,本研究以5個(gè)家兔群作為試驗(yàn)材料,對其FGF5基因部分外顯子1進(jìn)行遺傳變異檢測,以期找到與毛質(zhì)性狀相關(guān)遺傳標(biāo)記。1材料和方法1.1色完成色兔和長毛兔的生產(chǎn)本研究選取5個(gè)群體共523只家兔作為試驗(yàn)材料。其中,60只福建黑兔來自于福建省農(nóng)科院,130只有色獺兔和100只白色獺兔來自于浙江余姚兔場,68只九疑山兔來自于湖南省寧遠(yuǎn)縣九疑山兔原種場,165只皖系長毛兔來自于江蘇宜興拉必得兔場。所有個(gè)體均為隨機(jī)抽樣,耳緣靜脈采血5ml,并采用酚/氯仿的方法進(jìn)行總DNA提取。1.2片段長度和長度參考Mulsant設(shè)計(jì)的引物,擴(kuò)增出兔FGF5基因外顯子1的部分片段,預(yù)期片段長度為350bp。引物序列為:F1:5’-CCAGAATCAGCCCTACAAGATGCAC-3’,R1:5’-GATGGAAACCGATGACCACTCTGC-3’。1.3pcr擴(kuò)增及測序PCR擴(kuò)增總體積為20μL:1μLDNA模板(100ngμL),2μL10×PCRBuffer,1.5μLdNTP(10mmol/L),上下游引物各1μL(10pmol/μL),Taq酶為0.2μL(5U/μL),ddH2O13.3μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min,94℃變性40s,58℃退火40s,72℃延伸40s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測后,進(jìn)行酶切,酶切體系總體積是10μl,其中包括5μlPCR產(chǎn)物,1μBuffer,0.2μlEAM1104I酶和3.8μlddH2O。將整個(gè)酶切體系放入37℃水浴鍋中3h。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,10V/10cm電泳4～5h,銀染顯色,根據(jù)其多態(tài)性進(jìn)行分型。選取不同基因型的純合子進(jìn)行切膠回收,由上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。實(shí)驗(yàn)所用的DNA聚合酶和dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司。1.4基因型分布差異的分析統(tǒng)計(jì)基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、期望雜合度(He),并對各群體基因型分布差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn),Align軟件進(jìn)行序列比對和突變位點(diǎn)的篩查。2結(jié)果2.1fgf5基因型檢測將引物擴(kuò)增出的家兔FGF5基因部分外顯子1的產(chǎn)物進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,擴(kuò)增片段長度與預(yù)期片段大小一致,且特異性較好,沒有非特異性條帶。FGF5部分外顯子1的PCR產(chǎn)物經(jīng)RFLP檢測后發(fā)現(xiàn)3種基因型(A1A1、A1A2和A2A2型)(結(jié)果見圖1)。A1等位基因經(jīng)酶切后得到3個(gè)片段,分別是79bp、127bp和143bp;A2等位基因經(jīng)酶切后得到2個(gè)片段,分別是79bp和267bp。A2等位基因在所擴(kuò)增序列220-222位點(diǎn)存在TCT缺失(如圖2),從而導(dǎo)致所編碼的多肽鏈缺失一個(gè)絲氨酸。2.2哈代-溫伯格平衡所檢測的群體中,3種基因型只有在有色獺兔和白色獺兔群體中同時(shí)被發(fā)現(xiàn),福建黑兔和九疑山兔群體均只檢測到A1A1、A1A2基因型,而皖系長毛兔群體只檢測到A1A1基因型,且5個(gè)家兔群體均處于哈代-溫伯格平衡(見表1)。獺兔群體表現(xiàn)為中度多態(tài),其中,有色獺兔的期望雜合度和多態(tài)信息含量最高,分別為0.325和0.272。肉兔群體表現(xiàn)為低度多態(tài),毛兔無多態(tài)。皖系長毛兔與其他家兔群體之間分布差異極顯著(P<0.01),九疑山兔與有色獺兔之間分布差異顯著(P<0.05),其他群體間不存在分布差異(P>0.05)(見表2)。3fgf5基因序列及擴(kuò)增空間研究近年來,在鼠中FGF5基因?qū)Ρ幻挠绊懸蜒芯康幂^為深入。有研究證明該基因的突變對被毛的長度有顯著影響,并檢測到該基因在皮膚毛囊的表達(dá),同時(shí)用體外注射蛋白產(chǎn)物進(jìn)一步驗(yàn)證了FGF5的蛋白產(chǎn)物對不同時(shí)期毛囊生長具有一定的影響。高愛琴等對不同綿羊和山羊品種的FGF5基因外顯子1和3的多態(tài)性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)綿羊和山羊FGF5基因外顯子1均存在2處單堿基變異,而外顯子3并沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)。Housley等對狗FGF5基因進(jìn)行了序列分析,發(fā)現(xiàn)了兩處突變,通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)其中的一處錯(cuò)義突變與毛發(fā)長度有相關(guān)性。Drogemüller等檢測了貓F(tuán)GF5基因多態(tài)性,共發(fā)現(xiàn)了4處SNPs,其中有3處SNPs等位基因頻率分布在長毛貓、短毛貓以及雜交貓中有明顯的差異。Kehler等對28個(gè)貓群體的FGF5基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了4處堿基突變,將基因序列翻譯成氨基酸后發(fā)現(xiàn)每處突變都會干擾FGF5蛋白的生物學(xué)活性,相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)FGF5基因突變個(gè)體伴隨著長毛表型,并以常染色體隱性的方式遺傳。而本研究在進(jìn)行序列分析后,只發(fā)現(xiàn)一處TCT(絲氨酸)插入/缺失,這可能是由于突變位點(diǎn)在群體間存在差異造成的。此處的插入/缺失可能造成氨基酸序列的改變,從而使得家兔表現(xiàn)型發(fā)生改變。本試驗(yàn)所選的5個(gè)家兔群體的FGF5基因外顯子1中,A1等位基因均為優(yōu)勢等位基因。且長毛兔群體中未發(fā)現(xiàn)A2等位基因,可能是由于A1等位基因決定了毛兔的長毛這種