一株兔金黃色葡萄球菌的分離鑒定

一株兔金黃色葡萄球菌的分離鑒定

1.2細(xì)菌培養(yǎng)和dna提取按照傳統(tǒng)方法，直接涂片上述疾病，進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)。將上述病料斜面接種普通瓊脂平板和血瓊脂平板,37℃厭氧和有氧條件下分別培養(yǎng)24h,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,觀察菌體形態(tài)及染色特性,選取疑似菌落進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h。按照常規(guī)方法進(jìn)行生化鑒定。取健康家兔6只,其中4只靜脈注射24h細(xì)菌液體培養(yǎng)物0.5mL/只(108CCU/mL),另外2只作為對(duì)照,靜脈注射生理鹽水0.5mL/只,對(duì)死亡家兔進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。參照試劑盒說明書進(jìn)行。以CTAB法提取該株細(xì)菌的基因組DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;陰性對(duì)照以純水代替細(xì)菌基因組DNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至DH5α,酶切鑒定的陽性克隆株送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。2bsh1菌株的分離和鑒定病料直接涂片鏡檢可見到均勻一致多以成對(duì)排列的革蘭氏陽性球菌,圓形或卵圓形葡萄狀和短鏈狀的球菌。也可見單個(gè)或不規(guī)則葡萄串狀排列。從肝臟、肺臟和脾臟病料中都分離到了細(xì)菌,均在普通瓊脂平板和血瓊脂平板生長(zhǎng)為圓形、稍隆起、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落,菌落直徑約3mm,血瓊脂平板上有溶血現(xiàn)象。取菌落涂片,革蘭氏染色鏡檢,可見革蘭氏陽性的單在或成雙、多以成雙排列的球菌(圖1)。在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng),呈均勻混濁、有菌環(huán),瓶底有少量灰白色沉淀物,上述培養(yǎng)基生長(zhǎng)的細(xì)菌形態(tài)特性與病料直接鏡檢結(jié)果基本相似,將分離菌株暫命名為BTSH1。將BTSH1菌株純培養(yǎng)物接種于生化反應(yīng)管中,根據(jù)說明書要求的不同時(shí)間觀察并記錄,能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖,不發(fā)酵甘露醇,不產(chǎn)生硫化氫和靛基質(zhì),不能利用枸櫞酸鹽,甲基紅試驗(yàn)陽性,VP試驗(yàn)陽性,凝固酶試驗(yàn)陽性,經(jīng)鑒定完全符合金黃色葡萄球菌的特性(表1)。攻毒組2d后,出現(xiàn)肺炎癥狀后死亡,對(duì)照組觀察一周全部健活,死亡兔剖檢可見肺臟出血,胃、心臟、心肌及其他臟器組織有大小不一的膿腫病變與自然病例相似,取肺臟病灶部材料培養(yǎng)分離經(jīng)鑒定與接種菌一致。對(duì)提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行16SrRNA序列的PCR擴(kuò)增,獲得了與預(yù)期片段大小相符的擴(kuò)增條帶(1505bp),而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。將所得到的序列與GenBank中FJ899095.1金黃色葡萄球菌株16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì),其中第33位、462位、508位、1438位發(fā)生突變,同源性達(dá)到99.6%。3細(xì)菌分離及病兔的發(fā)病細(xì)菌的rRNA有23SrRNA、16SrRNA和5SrRNA。16SrRNA序列含有進(jìn)化速率不同的區(qū)域-可變區(qū)與恒定區(qū),以及多個(gè)重復(fù)的核苷酸三聯(lián)體序列;不同種屬的細(xì)菌,其16SrRNA序列有差異。根據(jù)這些特點(diǎn),16SrRNA常被用于細(xì)菌種屬的鑒定和分類,該方法具有很高的敏感性和特異性,被國(guó)內(nèi)外很多研究者應(yīng)用于病原菌的同源性分析與鑒定(Soumitesh等,2007)。經(jīng)過流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化及對(duì)病兔臟器細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、動(dòng)物感染試驗(yàn)和16SrRNA的序列分析,確定該兔場(chǎng)流行的疾病是由金黃色葡萄球菌感染所引起的。葡萄球菌對(duì)麥芽糖和甘露醇的發(fā)酵因菌株不同而有差異,該株金黃色葡萄球菌能夠發(fā)酵麥芽糖不發(fā)酵甘露醇。葡萄球菌大多是呈不規(guī)則的葡萄串狀或短鏈排列,有少數(shù)單在或成雙排列,但這次分離到的球菌鏡檢多為成雙排列,再加上病兔有肺炎癥狀并且剖檢發(fā)現(xiàn)肺部病變比較嚴(yán)重,所以懷疑是兔肺炎雙球菌感染,但最后經(jīng)過16SrRNA的擴(kuò)增及序列分析,確診為金黃色葡萄球菌感染,所以針對(duì)如今病原感染所引起癥狀和病變的復(fù)雜性,對(duì)分離菌的分子生物學(xué)鑒定還是很有必要的。最近有研究人員發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌可以在72h之造成患者患肺炎死亡(Susan等,2007)。由葡萄球菌引起的長(zhǎng)毛兔肺炎癥狀臨床上比較罕見,應(yīng)引起養(yǎng)兔生產(chǎn)者和獸醫(yī)工作者的高度重視。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界,養(yǎng)兔生產(chǎn)者應(yīng)經(jīng)常保持兔舍、兔籠的清潔衛(wèi)生,做好定期消毒來預(yù)防本病。同時(shí)應(yīng)用金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物制成的滅活菌苗,通過免疫接種,可起到較好的效果,但需要對(duì)本動(dòng)物進(jìn)行安全性和保護(hù)率的試驗(yàn)合格后方可使用。兔葡萄球菌病是由金黃色葡萄球菌引起的家兔的一種常見病,以敗血癥或各種器官的化膿性炎癥為特征(王云峰等,1997;黃曉紅,2005)。臨床表現(xiàn)為消瘦、精神沉郁,伴有腹瀉。不分性別、年齡、品種,兔對(duì)該病均易感,一年四季均可發(fā)生,尤以氣候溫暖和潮濕季節(jié)多發(fā)(Franklin等,1998;Silvija等,1998)。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,菌體較大,常呈葡萄狀,有時(shí)呈雙球或短鏈狀排列。2010年11月2日,內(nèi)蒙古包頭市某小型養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的300只長(zhǎng)毛兔開始發(fā)病,11月4日,已經(jīng)死亡46只,有近50只長(zhǎng)毛兔精神沉郁,眼紅流淚,流鼻涕,拉稀糞,有的帶黏液并污染后肢及肛門,在頭、頸、背、腿等部位個(gè)別有腫塊,剖檢發(fā)現(xiàn)病兔肝臟、脾臟、特別是肺臟紅腫、硬結(jié),膿腫小如豌豆,數(shù)目不一,有的肺臟和氣管出血,膽囊腫大。采集病兔肝臟、脾臟和肺臟組織,用密封病料盒包裝帶回實(shí)驗(yàn)室,由實(shí)驗(yàn)人員分離鑒定到了一株兔金黃色葡萄球菌。1材料和方法1.1細(xì)菌細(xì)胞dna提取內(nèi)蒙古包頭市某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)兔球菌病特征性病變的長(zhǎng)毛兔肝臟、脾臟和肺臟組織作為被檢材料。1.5～2.0kg兔由綠都生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。染色液及培養(yǎng)基由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室配制保存;各類生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;限制性內(nèi)切酶、DL2000、Taq酶、pMD18-T載體、EcoRⅠ和SalⅠ酶,均購(gòu)自TaKaRa公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。根據(jù)GenBank已發(fā)表的葡萄球菌的16SrRNA序列,設(shè)計(jì)1對(duì)引物,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1505bp,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列如下:P1:5′-AGAGTTTGAT-CMTGGCTCAG-3′,P2:5′-TACGGYTACCTTG-TTACGACT-3′。1.1.1疾病信息來源1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物1.1.3試劑1.1.4引用產(chǎn)品1.2.1