實時熒光定量pcr檢測shh基因在不同周齡皮膚中的表達規(guī)律

實時熒光定量pcr檢測shh基因在不同周齡皮膚中的表達規(guī)律

哈?；鬵信號通道是與毛囊生長相關的信號通道之一。hegghog蛋白的編碼基因包括shh、ih和dhh。shh是heggoog蛋白的主要編碼基因。shh參與了毛發(fā)生長和毛發(fā)休止期的轉化過程。Shh基因的功能受到Patched和Smoothened兩種跨膜蛋白的調節(jié),Patched蛋白既可以作為Shh配體的受體,也可以作為Smoothened蛋白的負調控因子。Shh前體蛋白經過剪切與修飾形成19kDaN端蛋白和25kDaC端蛋白,C端蛋白可以將膽固醇分子轉移到ShhN端蛋白的C端,從而使N端蛋白的作用區(qū)域得到有效控制。長毛兔原名安哥拉兔,起源于小亞細亞一帶,1723年由英國引進到法國,隨后分布于世界各地,過去主要有英、德、法和中4個不同的品種。德系長毛兔引入我國后,主要用于改良中系長毛兔,在提高我國長毛兔產毛量和改進兔毛品質方面發(fā)揮了重要作用。目前,我國長毛兔養(yǎng)殖數(shù)量占世界的90%,兔毛產量占世界的95%以上。皖系長毛兔(WanstrainAngoraRabbit)是安徽省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所歷經20余年的系統(tǒng)選育而成,于2010年7月順利通過國家畜禽遺傳資源委員會新品種審定,并于當年獲頒國家級畜禽新品種證書。皖系長毛兔的被毛特征是:全身絨毛厚密、潔白、光亮。被毛有毛叢結構,但不纏結,有明顯波浪形彎曲。多有額毛,部分有頰毛,耳背有稀疏短毛,耳尖有一撮長毛。四肢、腹部密生絨毛;體毛細長柔軟,排列整齊,全身槍毛稀少。比利時兔又稱巨灰兔、弗朗德巨兔,是英國育種家用原產于比利時貝韋倫一帶的野生穴兔改良育成的優(yōu)良肉用兔。比利時兔被毛呈黃褐色或栗殼色,毛尖略帶黑色,腹部灰白,兩眼周圍有不規(guī)則的白圈,耳尖部有黑色光亮的毛邊,比利時兔被毛堅韌性較好,毛色具有天然光澤,皮張面積大,皮板的彈性和柔性好。目前相關研究證明Shh基因參與毛囊生長發(fā)育相關過程,但是對Shh基因的研究主要集中在人和鼠上,至今還無該基因在家兔上的相關研究。因此本試驗以皖系長毛兔和比利時兔為試驗材料,研究Shh基因在其皮膚組織中的表達規(guī)律,旨在初步探究該基因的表達情況與兔毛生長的相關性。1材料和方法1.1保養(yǎng)兔的制備皖系長毛兔和比利時兔的皮膚組織樣均采自安徽省農科院種兔場,對母兔同期配種,同期產仔,所產仔兔飼養(yǎng)在同一環(huán)境條件下,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22周齡每個品種選擇健康公、母兔各3只,采集體側部和臀部皮膚各2g左右,投入液氮中,后轉入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2熒光定量試劑盒Agilent安捷倫930882BrilliantIIISYBR,RNA提取試劑盒(Trizol)購自Lifetechnologies公司;DEPC和瓊脂糖購自SIGMA公司;FastQuantRTKit(WithgDNase)購自北京天根生化科技有限公司;熒光定量試劑盒(DRR081A)購自大連TaKaRa公司;主要儀器包括Agilent安捷倫MX3000P熒光定量儀器,制冰機購自SM公司,超低溫冰箱購自日本SANY公司,NanoDroPND-1000濃度測定儀購自美國GE公司,EPPendorffThermalCyclerPCR儀購自德國EPPendorf公司。1.3方法1.3.1熒光定量引物的設計與合成根據(jù)GenBank中家兔GAPDH和Shh基因的cDNA序列,利用Primer3.0設計兩個基因的特異性熒光定量引物,引物由上海生物工程公司合成,引物序列見表1。1.3.2nanodropnd-100血清蛋白的檢測利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本總RNA的完整性,并用NanoDropND-1000濃度測定儀測定RNA濃度,最終將每個RNA樣本取出一部分稀釋至100ng/μL,放入-70℃冰箱中保存。1.3.3周齡體側部和下頜的rna反轉錄合成利用FastQuantRTKit(WithgDNase)(北京天根生化科技有限公司)將上述皖系長毛兔和比利時兔各個周齡體側部和臀部的RNA反轉錄合成cDNA,按試劑盒進行反轉錄操作。1.3.4dna的制備實時熒光定量PCR試驗20μL體系:上游引物1μL,下游引物1μL,模板cDNA1μL,SYBRPremix10μL,雙蒸水7μL。反應程序為:95℃預變性10min;95℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸25s,共45個循環(huán);95℃1min,55℃30s,95℃30s。1.3.5實時熒光定量pcr數(shù)據(jù)實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析,先用EXCEL初步處理Shh基因的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù),相對定量的結果采用2-ΔΔCt算法進行處理(ΔΔCt=(待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct-對照組管家基因平均Ct值))。2結果與分析2.1蛋白含量測定1%瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性,核酸蛋白測定儀測定濃度,稀釋至100ng/μL,-70℃保存?zhèn)溆?。由圖1可知,提取的RNA28S、18S條帶清晰,無明顯降解。2.2周齡公兔林各周齡shh基因表達量以0周齡皖系長毛兔公兔臀部中Shh的表達量為內對照,采用2-ΔΔCt法計算Shh基因在皖系長毛兔不同性別、不同周齡、不同部位中的相對表達量。由圖2可見,Shh基因在皖系長毛兔的整個生長發(fā)育過程中均有一定量的表達,除公兔體側部外,其它均在0~2周齡呈上升趨勢。母兔體側部在4、8周齡的相對表達量較高,母兔臀部18周齡明顯上調;10、14和18周齡公兔臀部Shh基因表達也較高,呈波動性,公兔體側部0、18和22周齡Shh基因表達較高。公兔體側部在0和22周齡的表達變化趨勢與其他3組不同,表現(xiàn)為0~4周齡下降,20~22周齡上升的趨勢。母兔體側部在2~12周齡的變化趨勢不同于其他3組,呈現(xiàn)“上升→下降→上升→下降→上升”的趨勢。除4周齡和8周齡外,公兔體側部的相對表達量顯著高于其他3組,18周齡時,母兔臀部和公兔體側部顯著高于另外兩組,其他組中,公母之間或者部位之間均差異不顯著(P>0.05)。2.3建兔前兔的性別、周齡、部位分布以0周齡比利時公兔臀部中Shh的表達量為內對照,采用2-ΔΔCt法計算Shh基因在比利時兔不同性別、不同周齡、不同部位中的相對表達量。由圖3可見,Shh基因在比利時兔不同周齡、不同性別、不同部位中相對表達量變化趨勢基本一致,除公兔臀部0~4周齡呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢外,其他均表現(xiàn)為0~2周齡上升,2~8周齡下降,8~22周齡表達量相對較低,且變化幅度較小。3shh基因在發(fā)育的過程中的表達Hedgehog蛋白的編碼基因有Shh、Ihh和Dhh基因,其中Shh是Hedgehog蛋白的主要編碼基因,Shh參與調控毛囊生長和毛囊休止期向生長期轉換的過程。Shh是毛囊在胚胎期時形態(tài)發(fā)生的必要信號分子,如果小鼠發(fā)生Shh基因突變,則不會出現(xiàn)皮膚上皮內陷,從而阻斷胚胎期毛囊形態(tài)的發(fā)生。Mill等通過皮下注射的方式,給19日齡C57BL/6的小鼠注射腺病毒載體Shh,發(fā)現(xiàn)注射Shh處皮膚中Shh表達量增加,并刺激了處于休止期的毛囊加速進入生長期,2周后發(fā)現(xiàn)小鼠注射處皮膚新生毛發(fā)的速度比非注射處皮膚新生毛發(fā)速度快。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)Shh參與內皮細胞的增殖、修復過程,Song等將環(huán)杷明(Shh的阻斷劑)注射到小鼠胚胎中,發(fā)現(xiàn)明顯影響了小鼠的血管細胞的增殖、分化。蘇蕊等分析了Shh基因在內蒙古絨山羊皮膚毛囊發(fā)育生長期和休止期皮膚中的表達,結果顯示:休止期的Shh基因表達水平是生長期的0.22倍。本研究中Shh基因在皖系長毛兔和比利時兔0周齡時均有一定的表達量,說明該基因在家兔胚胎期就開始表達,但是Shh基因在兩個兔品種中的表達變化趨勢并不完全一致,此結果可能是兩個兔品種的經濟用途不同導致的。除皖系長毛兔公兔體側和比利時兔母兔臀部,其他6組在0~2周齡,Shh基因的表達量均呈現(xiàn)上升趨勢,吳添文的研究表明:0周齡時,初級毛囊周圍分布的次級毛囊數(shù)量較少,2周齡時,次級毛囊的數(shù)量明顯上升,亞毛囊群中的次級毛囊數(shù)普遍為5~12個,即0~2周齡時,家兔的毛囊處于一個快速生長期,這與本研究的結果一致,說明Shh基因在毛囊生長旺盛期表達量相對較高。Shh基因在皖系長毛兔0~22周齡的表達量均相對較高,比利時兔0~6周齡時表達量相對較高,8~22周齡表達量相對較低且變化趨勢較為平緩。皖系長毛兔為毛用型兔,其被毛生長較快且在整個生命過程均在生長,但比利時兔為肉用型兔,其被毛長到一定階段,便開始緩慢生長,甚至停止生長。本研究結果發(fā)現(xiàn)Shh基因在比利時兔8~22周齡表達