肌動(dòng)蛋白微絲在偽足形成中的作用

肌動(dòng)蛋白微絲在偽足形成中的作用

偽腳是最原始的活動(dòng)器官，包括maba細(xì)胞和其他親乳細(xì)胞。目前認(rèn)為,偽足的形成是由于骨架再組裝驅(qū)動(dòng),特別是肌動(dòng)蛋白微絲骨架的重組。偽足表現(xiàn)為一個(gè)突出的小泡,有時(shí)沿著下層基質(zhì)變得扁平(像扁平足),有時(shí)更圓或離開(kāi)表面(像頭足)。熒光顯微鏡和電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn),這個(gè)區(qū)域總是包含有密集的纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)微絲網(wǎng)絡(luò)和少量的微管。在活體細(xì)胞中,肌動(dòng)蛋白(actin)的聚合主要發(fā)生在細(xì)胞延伸的邊緣,通過(guò)膜和微絲末端之間新增肌動(dòng)蛋白單體的方式。用細(xì)胞骨架干擾劑限制actin的聚合,提供了直接的證據(jù)來(lái)說(shuō)明actin微絲在移動(dòng)中所起的作用。盡管actin微絲在偽足形成時(shí)所起的作用已被人們接受,但對(duì)于產(chǎn)生推力的機(jī)理仍有不同見(jiàn)解。涉及到推力的模型,從肌動(dòng)蛋白聚合在膜上直接起作用到肌漿球蛋白的收縮或可利用的凝膠滲透壓驅(qū)使F-actin網(wǎng)絡(luò)的凝膠化等,均被提出說(shuō)明偽足的擴(kuò)展。肌動(dòng)蛋白的形成微絲骨架(mirofilamentcytoskeleton)是細(xì)胞骨架的一種,微絲直徑僅5~8nm,呈圓筒狀,在細(xì)胞質(zhì)中成束狀平行排列或疏散成網(wǎng)狀。它主要是由肌動(dòng)蛋白組裝的多聚體,和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-輔肌動(dòng)蛋白等組成。前者又稱為肌動(dòng)蛋白纖絲(actinfilaments),它具有高度的動(dòng)態(tài)性,即未組裝的球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)與F-actin在胞內(nèi)可以隨時(shí)組裝和解聚。有時(shí)可以是球狀蛋白組裝的單絲存在于細(xì)胞內(nèi),或幾個(gè)單絲組成的束,有時(shí)也可以看到更粗的集合體,稱為肌動(dòng)蛋白索(actincables)。正常細(xì)胞中,G-actin與F-actin不斷轉(zhuǎn)換,達(dá)到平衡,并且只有聚合態(tài)的肌動(dòng)蛋白才具有生物學(xué)作用。肌動(dòng)蛋白是由兩個(gè)形似蠶豆瓣的區(qū)域構(gòu)成的球狀分子,中間由一個(gè)分子多肽鏈相連。存在一個(gè)中縫,中縫部分是肌動(dòng)蛋白的必要因子ATP或ADP的金屬離子的結(jié)合部分。這些因子決定著它的穩(wěn)定狀態(tài)。在哺乳動(dòng)物中至少發(fā)現(xiàn)了6種肌動(dòng)蛋白肽,根據(jù)其電泳特點(diǎn)又將肌動(dòng)蛋白分為α、β、γ3種。α-actin主要位于骨骼肌和心肌細(xì)胞,β-actin、γ-actin主要存在于非肌肉細(xì)胞中。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白可以特異地與各種形式的肌動(dòng)蛋白結(jié)合或分離,調(diào)節(jié)微絲的聚合、解離。細(xì)胞松弛素B則破壞微絲。微絲骨架大約有70多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白及輔助的解聚蛋白,在肌動(dòng)蛋白的折疊、聚合、交聯(lián)、成晶現(xiàn)象及運(yùn)動(dòng)中起主要調(diào)節(jié)作用,包括跨連接蛋白(fimbrin、ABP-120、α-actinin等)、單體結(jié)合蛋白(cofilin、profilin、CAP)、膜錨蛋白(talin、comitin、ponticulin)、F-actin片斷和帽子蛋白(severin、DAip1),聚合啟動(dòng)子(WASP,Scar)和馬達(dá)蛋白(myosin),這些蛋白常被Ca2+或磷酸肌醇等信號(hào)分子調(diào)節(jié)。如肌動(dòng)蛋白的一個(gè)重要調(diào)節(jié)蛋白是profilin,它與自由單體肌動(dòng)蛋白和F-actin的末端結(jié)合,阻止actin進(jìn)一步聚合。profilin含有磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)結(jié)合位點(diǎn),對(duì)PIP2具有高親合性,可抑制磷脂酶C(PLC)活性和PIP2水解。profilin結(jié)合PIP2后與微絲脫離,有利于肌動(dòng)蛋白聚合,調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白單體濃度。另外它還可作為ADPactin和ATPactin的轉(zhuǎn)換因子。這些說(shuō)明profilin在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合過(guò)程中受到磷酸肌醇信號(hào)分子的作用。微絲骨架系統(tǒng)是一類復(fù)雜的蛋白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的病理過(guò)程,如細(xì)胞的趨化、粘附、粘彈等過(guò)程密切相關(guān)。與此同時(shí),細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞分裂、胞內(nèi)物資的運(yùn)輸和細(xì)胞分化等活動(dòng)都與細(xì)胞骨架相關(guān)。所以,胞質(zhì)骨架的改變必然影響細(xì)胞功能。細(xì)胞移動(dòng)的影響趨化原是單細(xì)胞生物最基本、最原始的運(yùn)動(dòng)形式,如變形蟲(chóng)、溶組織阿米巴等靠體表任何部位形成臨時(shí)性的細(xì)胞質(zhì)突起(偽足)作為運(yùn)動(dòng)器而運(yùn)動(dòng)。所謂的趨化性,即是細(xì)胞朝向可溶性化學(xué)刺激方向遷移。某些真核細(xì)胞,如白細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等體內(nèi)也具有明顯的趨化運(yùn)動(dòng),且有些細(xì)胞自身可以分泌趨化因子。這些趨化因子在生理和非生理狀況下起重要作用,如可以促進(jìn)細(xì)胞遷移,刺激血管的生成,參與腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,促使多種淋巴因子的釋放等。細(xì)胞偽足形成及趨化運(yùn)動(dòng)是由趨化劑與細(xì)胞膜趨化受體結(jié)合后介導(dǎo)的主動(dòng)耗能過(guò)程。它不同于細(xì)胞與外力作用下的被動(dòng)變形。細(xì)胞的各種運(yùn)動(dòng),如變形蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)(或阿米巴運(yùn)動(dòng))、變皺膜運(yùn)動(dòng),以及細(xì)胞的吞噬活動(dòng)等,都與肌動(dòng)蛋白的溶膠、凝膠狀態(tài)及其相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),偽足形成過(guò)程中微絲(肌動(dòng)蛋白)組裝在細(xì)胞移動(dòng)中起著重要作用。除了肌動(dòng)蛋白的聚合,還有另外的幾種可能的機(jī)理,如凝膠滲透壓力,在細(xì)胞移動(dòng)中也起一定的作用;如嗜中性粒細(xì)胞的趨化性偽足形成的受體作用機(jī)制,以及一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,如胞內(nèi)鈣離子的釋放、G蛋白偶聯(lián)的肌動(dòng)蛋白的解聚,以及信號(hào)分子、細(xì)胞骨架不對(duì)稱和有持續(xù)的分配引起的細(xì)胞的極性等,倍受研究者關(guān)注。原生動(dòng)物變形蟲(chóng)在固體表面移動(dòng)時(shí),向前伸出一個(gè)或多個(gè)偽足,將體內(nèi)部分原生質(zhì)移入偽足內(nèi),后面的原生質(zhì)也隨著收縮前進(jìn),不斷地補(bǔ)充向前流動(dòng)的原生質(zhì),整個(gè)細(xì)胞逐漸移向前方。變形蟲(chóng)就是這樣依靠細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)流動(dòng)才向前運(yùn)動(dòng)和捕捉食物的。這種原生質(zhì)流動(dòng),實(shí)質(zhì)上是依靠微絲的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白聚合體之間的滑動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如果變形蟲(chóng)經(jīng)細(xì)胞松弛素B處理,即可中止原生質(zhì)流動(dòng)和偽足的擴(kuò)散。表明微絲參與了非肌肉細(xì)胞的變形運(yùn)動(dòng)。高等動(dòng)物中白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)也與上述變形蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)相似。在哺乳類成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中,可觀察到細(xì)胞膜表面皺縮,形成若干波動(dòng)式的褶皺和較長(zhǎng)的突起。細(xì)胞移動(dòng)就是依靠這些褶皺和突起,不斷交替與表面相接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在移動(dòng)時(shí),原生質(zhì)也跟著流動(dòng),但僅出現(xiàn)于細(xì)胞邊緣區(qū)。如果用細(xì)胞松弛素B處理,即觀察到皺縮運(yùn)動(dòng)受到抑制;當(dāng)除去細(xì)胞松弛素B(1~2h),這種運(yùn)動(dòng)可逐漸恢復(fù)。由此可見(jiàn),細(xì)胞產(chǎn)生皺膜的運(yùn)動(dòng)也與細(xì)胞骨架微絲有關(guān)。Francis等通過(guò)電鏡,觀察了鼠Sca-1+/Lin-細(xì)胞和人類KG1a細(xì)胞在細(xì)胞移動(dòng)中的多樣性形態(tài)。像典型的手鏡形偽足、寬廣的扁平足、尾足、動(dòng)態(tài)的絲狀偽足、伸縮纖維等。Dictyostelium細(xì)胞在其生長(zhǎng)環(huán)境中也顯示了趨化性現(xiàn)象,如在生長(zhǎng)環(huán)階段攝取細(xì)菌,及性循環(huán)階段形成巨囊等。細(xì)胞的極性在某種形式上也是趨化的過(guò)程,如單細(xì)胞核和多細(xì)胞核的dictyostelium產(chǎn)生分級(jí)階段,早期趨化時(shí)需要單個(gè)細(xì)胞迅速重組裝其細(xì)胞骨架來(lái)產(chǎn)生cAMP,這就涉及到F-actin聚合并在相反的方向上抑制偽足。大量的研究主要在集合體階段,細(xì)胞朝向脈動(dòng)的cAMP信號(hào)方向移動(dòng),發(fā)展中的dictyostelium細(xì)胞在cAMP資源豐富區(qū)延伸偽足,改變其極性。胞膜自身力學(xué)特性的改變應(yīng)用細(xì)胞及分子生物學(xué)方法,人們對(duì)阿米巴原蟲(chóng)、中性白細(xì)胞以及部分癌細(xì)胞,如惡性黑色素瘤細(xì)胞的趨化行為已有相當(dāng)?shù)难芯?但對(duì)于趨化運(yùn)動(dòng)的機(jī)理、偽足形成的機(jī)制還遠(yuǎn)未達(dá)到詳細(xì)的了解,如趨化相關(guān)受體機(jī)制、偽足形成的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制、偽足形成的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(如細(xì)胞骨架等)等機(jī)制。對(duì)上述問(wèn)題的研究將極大提高對(duì)偽足形成過(guò)程及相關(guān)趨化機(jī)理的認(rèn)識(shí),并促進(jìn)癌轉(zhuǎn)移、免疫炎癥等醫(yī)學(xué)問(wèn)題的研究。癌細(xì)胞偽足形成及趨化運(yùn)動(dòng)是癌細(xì)胞侵襲過(guò)程中的重要生物學(xué)行為。偽足形成涉及一系列的復(fù)雜的相互作用,如趨化劑和趨化受體的結(jié)合及有關(guān)信號(hào)機(jī)制、細(xì)胞膜局部力學(xué)特性的改變、肌動(dòng)蛋白解聚及滲透壓的作用、肌動(dòng)蛋白聚合以及鈣離子的作用。這些研究對(duì)于在細(xì)胞生物學(xué)水平認(rèn)識(shí)偽足形成極性或細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)方向性的相關(guān)機(jī)理具有重要的理論和應(yīng)用意義。為解釋促使偽足形成的趨動(dòng)力,形成了很多研究模型,它們主要建立在肌動(dòng)蛋白生物化學(xué)和某些細(xì)胞在趨化液刺激下其內(nèi)部細(xì)胞骨架改變的基礎(chǔ)上。以此兩種材料研究居多:多形核白細(xì)胞(PMN)和Dictyostelium。并根據(jù)其細(xì)胞的變形提出了兩種很有影響力的模型,分別是PMN模型和皮層擴(kuò)展模型。皮層擴(kuò)展模型認(rèn)為,經(jīng)過(guò)趨化受體刺激后,局部肌動(dòng)蛋白的聚合和跨連接是使細(xì)胞偽足形成的瞬間原動(dòng)力。而后跟隨的肌動(dòng)蛋白凝膠的滲透膨脹引起微絲的解聚,促進(jìn)偽足的進(jìn)一步擴(kuò)展。而PMN模型則認(rèn)為,起初偽足延伸的作用力是局部的Ca2+激活的肌動(dòng)蛋白凝膠的解聚,由此產(chǎn)生的滲透力膨脹使得細(xì)胞膜向外突出,于是形成了偽足。而PMN模型對(duì)偽足形成階段肌動(dòng)蛋白解聚和聚合方面作了明確的區(qū)分。它認(rèn)為,受體產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及通過(guò)Ca2+激活的凝膠蛋白的調(diào)節(jié)是引起局部肌動(dòng)蛋白解聚的原因。接著肌動(dòng)蛋白凝膠在細(xì)胞邊緣的瞬間分裂和膨脹,導(dǎo)致了膜的突出。由此看出,滲透壓是驅(qū)動(dòng)偽足形成的原動(dòng)力。后來(lái)的肌動(dòng)蛋白的重聚和跨連接加速和穩(wěn)定了新的偽足的形成。肌動(dòng)蛋白的重聚開(kāi)始于PI代謝循環(huán)。有學(xué)者應(yīng)用微管吸吮技術(shù)揭示在瘤細(xì)胞中的偽足形成有兩個(gè)時(shí)相:膜泡階段和規(guī)則延伸。此過(guò)程通過(guò)分開(kāi)的胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)節(jié)而完成。IV型膠原激活了G-蛋白偶聯(lián)的受體,刺激趨化,引起了短暫的胞內(nèi)鈣離子的釋放。運(yùn)用pertussistoxin(PT)限制細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的組裝,即阻斷了G-蛋白偶聯(lián)的actin的聚合,則細(xì)胞仍有小泡向外延伸,說(shuō)明滲透壓在起作用。然而,也有人研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子的增加對(duì)于肌動(dòng)蛋白聚合并不是必須的。偽足的形成機(jī)理細(xì)胞骨架在細(xì)胞的粘附、偽足形成等特性和過(guò)程中,起著非常重要的作用。現(xiàn)代研究越來(lái)越表明,粘附分子-受體-細(xì)胞骨架之間的相互作用,在胞內(nèi)外的信號(hào)傳遞過(guò)程中,起著越來(lái)越重要的作用。因此,對(duì)于特定細(xì)胞、特定胞外信號(hào),肌動(dòng)蛋白聚合和肌動(dòng)蛋白微絲的動(dòng)態(tài)分布在局部細(xì)胞移動(dòng)中所起的作用更不容忽視。許多細(xì)胞的移動(dòng)與肌動(dòng)蛋白和肌漿球蛋白I、II有關(guān)。除肌動(dòng)蛋白聚合之外,細(xì)胞的移動(dòng)還有其他幾種可能機(jī)理,如靜電壓力、膠體滲透壓、局部的跨膜滲透壓、界面張力或界面壓力等。實(shí)驗(yàn)表明,膠體和跨膜滲透壓最可能支配細(xì)胞的動(dòng)態(tài)移動(dòng)。為了分析肌動(dòng)蛋白聚合和肌動(dòng)蛋白凝膠的支配偽足形成的相關(guān)規(guī)律,人們?cè)谘芯緼crasisrosea和Protostelium噬真菌體等阿米巴的肌漿球蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能時(shí)也發(fā)現(xiàn),它們的F-actin束從內(nèi)生的質(zhì)膜與外部的質(zhì)膜間形成偽足,而那里也定位著G-actin。于是得出結(jié)論,這些肌動(dòng)蛋白束形成了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)支架驅(qū)動(dòng)著偽足的形成,因此得以繼續(xù)組裝更多松散的F-actin網(wǎng)絡(luò)。一些兩極伸長(zhǎng)的Acrasisrosea阿米巴也含有長(zhǎng)束的F-actin,橫越整個(gè)細(xì)胞并且遙控著散在細(xì)胞中的應(yīng)力纖維棒,或形成星狀或多邊形混合物圍繞在收縮性的液泡周圍。它們也許在收縮性上起著重要作用。結(jié)合從前發(fā)現(xiàn),偽足能夠通過(guò)actin和肌漿球蛋白的相互作用或者只是通過(guò)actin的聚合而形成,由此得出結(jié)論,actin微絲束趨動(dòng)著細(xì)胞偽足的延伸。在偽足形成時(shí),單個(gè)的actin微絲并不能充分剛性地推動(dòng)細(xì)胞膜外突,盡管它有巨大的力量。也有人提出偽足形成的兩個(gè)次序性事件是,首先F-actin束的形成和它們的延伸超過(guò)了細(xì)胞總體的邊緣,明顯的表現(xiàn)是偽足形成時(shí)細(xì)胞膜的突出。其次,具有凝膠性質(zhì)的F-actin網(wǎng)絡(luò)骨架的形成擴(kuò)充了偽足或者填充了它們的空間,而這正如皮層擴(kuò)展模型中所預(yù)料到的一樣。當(dāng)阿米巴突然改變了移動(dòng)的路徑,如偽足被收回,收回的纖維在偽足剛剛出現(xiàn)的區(qū)域形成。這表明,相對(duì)穩(wěn)定且動(dòng)態(tài)的F-actin束是偽足首要的支撐元素,首先出現(xiàn)在偽足的延伸和擴(kuò)展中,并在其收回時(shí)被破壞。Hodgson等曾以黑色素瘤細(xì)胞作為材料,研究其偽足形成機(jī)理,瘤細(xì)胞展示了同多形核白細(xì)胞和低等的真核細(xì)胞Dictyostelium一樣的阿米巴運(yùn)動(dòng),它們的移動(dòng)特征是偽足伸出到細(xì)胞的外圍。當(dāng)前絕大部分的阿米巴趨化機(jī)理來(lái)自于研究PMN白細(xì)胞和Dictyostelium阿米巴,而此兩種機(jī)理在某些方面也有相似性。偽足形成在趨化刺激作用下是最早的形態(tài)反應(yīng),而偽足是細(xì)胞皮層的特化區(qū),它主要包含有肌動(dòng)蛋白微絲的跨連接網(wǎng)絡(luò)。局部的趨化刺激引起了細(xì)胞外圍的肌動(dòng)蛋白微絲的重建,而導(dǎo)致了細(xì)胞偽足的延伸和細(xì)胞的移動(dòng)。然而偽足延伸中的胞外信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未闡明。為了研究活體細(xì)胞中actin細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)分布,Cheng等通過(guò)在真核細(xì)胞中表達(dá)β-actin-GFP,轉(zhuǎn)染入NIH3T3纖維原細(xì)胞、293T人類胚胎腎癌細(xì)胞中,通過(guò)免疫熒光染色決定其內(nèi)生的actin的位置。而在趨化劑作用下可以在線觀察β-actin-GFP組裝過(guò)程。當(dāng)趨化作用下偽足伸出時(shí),β-actin-GFP的數(shù)量在整個(gè)臨近細(xì)胞表面的皮層區(qū)開(kāi)始增加,隨著延伸的進(jìn)展,熒光在這些細(xì)胞中變得更易于區(qū)分,并在大約1h內(nèi)監(jiān)測(cè)到β-actin組裝的改變和相對(duì)高濃度的綠色熒光在細(xì)胞的外圍擴(kuò)展。Lee等又發(fā)現(xiàn),Dictyostelium阿米巴偽足形成時(shí),actin微絲組裝發(fā)生了改變。熒光鬼筆環(huán)肽用于研究Dictyostelium阿米巴運(yùn)動(dòng),目的是為了觀察偽足延伸時(shí)局部的F-actin微絲的改變。鬼筆環(huán)肽(profilin)起初定位在細(xì)胞的外圍,而新偽足的形成并未有熒光產(chǎn)生,表明鬼筆環(huán)肽是緊密結(jié)合在存在的F-actin微絲上,并未迅速重新定位到新形成的微絲上。隨著偽足的延伸,熒光信號(hào)從潛在的擴(kuò)展區(qū)消失,留下了一個(gè)actin皮層縫隙。在野生型細(xì)胞和肌漿球蛋白II重鏈缺失的細(xì)胞中得到了相似的結(jié)果。熒光信號(hào)從新的偽足形成區(qū)的消失,表明新的偽足形成并非建立在已存在的微絲皮層上,而是建立在局部被溶膠化作為新的actin網(wǎng)絡(luò)皮層上。在新偽足的延伸區(qū),熒光的缺失并不意味著這些結(jié)構(gòu)缺乏肌動(dòng)蛋白微絲。既然profilin非常緊密地結(jié)合到F-actin微絲上,因此交換不能迅速發(fā)生在新的偽足形成區(qū)。所以,在偽足延伸時(shí)電穿孔profilin只是出現(xiàn)在已存在的皮層actin網(wǎng)架結(jié)構(gòu)中,并沒(méi)有分布在新形成的actin微絲中。膜伸展以后則觀察到profilin區(qū)表面的解聚表現(xiàn)明顯。隨著延伸的加速,在皮層區(qū)熒光變得模糊并散開(kāi),特別在偽足形成的中心區(qū)。有時(shí)在皮層區(qū)出現(xiàn)明顯的熒光間隙。在缺乏myosinII的野生性細(xì)胞也有此結(jié)果,表明myosinII并不通過(guò)此機(jī)理來(lái)產(chǎn)生皮層間隙。細(xì)胞的極性是所有細(xì)胞的基本特征,它包含有很多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,如細(xì)胞的趨化過(guò)程。如果沒(méi)有極化細(xì)胞骨架,細(xì)胞不能夠移動(dòng)。已發(fā)現(xiàn)作用于細(xì)胞極性的幾種蛋白成分和信號(hào)途徑。生長(zhǎng)的細(xì)胞通過(guò)伸長(zhǎng)偽足迅速改變其極性。由于胞外的cAMP成分使細(xì)胞變得無(wú)極性,并停止運(yùn)動(dòng),此時(shí)被稱作萎縮反應(yīng)。通過(guò)F-actin聚合