am真菌和根瘤菌對紫穗槐的侵染及根部微生物趨化性研究

am真菌和根瘤菌對紫穗槐的侵染及根部微生物趨化性研究

微生物與植物共生是自然界中常見的生物學(xué)現(xiàn)象。其中，由甘草細菌和植物根系培育的互利共生體——羊根、根瘤菌和相應(yīng)的豆科植物組成的互利共生體——腫瘤一直是近年來共生體生物化學(xué)的熱點。而在一些豆科植物中,AM真菌-豆科植物-根瘤菌三者形成的共生體是微生物與植物共生的一種特殊類型。但到目前為止,國內(nèi)外對“AM真菌-宿主植物-根瘤菌”之間關(guān)系的研究都只是停留在對其現(xiàn)象上的描述和營養(yǎng)生理分析,關(guān)于菌根真菌、根瘤菌對宿主植物侵染的時間變化,共生體識別過程中的影響因子,二者間的信號物質(zhì)及趨化作用的研究到目前為止還未有全面報道。細菌的趨化作用就是指運動性細菌對其生長環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度所作出的趨向(正趨化)或遠離(負趨化)該化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)。本研究通過對AM真菌-木本豆科植物紫穗槐-根瘤菌三者之間聯(lián)合共生體模式系統(tǒng)的研究來探討菌根真菌、根瘤菌對宿主植物侵染的時間變化,并利用“根部微生物趨化試驗手段”分析共生體識別階段接種AM真菌對根瘤菌的趨化性及外界溫度對共生體識別的影響,目的是為了揭示AM真菌與根瘤菌之間的趨化關(guān)系、二者共生體形成早期信號物質(zhì)的存在與否及外界溫度對其共生體初始信號物質(zhì)的識別是否有調(diào)控作用,為今后共生體初始識別信號的研究提供一些方法,認識其共生現(xiàn)象的普遍性與特殊性,為其共生機理的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1紫穗槐苗木種子供試AM真菌為摩西球囊霉(Glomusmosseae,GM),該菌劑孢子含量為1630個孢子/20mL,由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供;供試植株紫穗槐苗木種子由吉林省林業(yè)科學(xué)研究院提供;供試根瘤菌菌株(Mesorhizbiumamorphae)來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1菌種的活化紫穗槐種子消毒(20℃～30℃的溫水搓洗后用0.3%KMnO4浸泡3h～4h)和催芽(20℃～30℃溫水中浸泡24h,隔天換水1次);然后將草碳土、細沙、蛭石按2:2:6的比例裝入錫紙做成的滅菌容器中,0.1MPa高壓蒸汽滅菌2h,用牛皮紙包起,自然晾干。隨后,對滅菌后的土壤做如下處理：(1)不接種土壤：滅菌后未做任何處理的混和土壤。(2)單接種AM真菌土壤：在滅菌后的混和土壤中按每千克加入1mL摩西球囊霉(Glomusmosseae,GM)菌劑,混和均勻。(3)單接種根瘤菌土壤：在滅菌后的混和土壤中按每千克加入1mL根瘤菌菌液,噴灑混和均勻。(4)雙接種土壤：在滅菌后的混和土壤中按每千克加入1mL摩西球囊霉(Glomusmosseae,GM)菌劑和1mL根瘤菌菌液,混和均勻。將催芽后紫穗槐種子種植在處理后的土壤中,對其不接種、單接種和雙接種得到如下品系：非接種植株(AM-+Rh-)、單接種AM真菌植株(AM+)、單接種根瘤菌植株(Rh+)、雙接種植株(AM++Rh+),作為研究材料。1.2.2乳酸酸性品紅染色在紫穗槐出苗后每隔1周取樣,對樣根進行觀察、處理,將洗凈的紫穗槐根段切成長度為1cm,放入裝有10mL10%KOH的試管內(nèi),于沸水中加熱、透明30min,水洗后加入5mL2%HCl溶液中和5min,再用蒸餾水清洗,加入乳酸酸性品紅溶液置于90℃下水浴30min進行染色,然后用乳酸甘油脫色,經(jīng)多次清洗后取樣鏡檢。在苗木生長的不同時期取樣觀察、分析AM真菌和根瘤菌在侵染根部過程中的相互關(guān)系,根據(jù)Trouvelot法計算菌根侵染率并對其根部出現(xiàn)根瘤情況進行觀察。1.2.3am真菌與根瘤菌間的趨化性測定越來越多的證據(jù)表明在AM真菌菌絲分枝期間,共生體各個成員之間開始初始信號識別,是初始識別信號最活躍的時期。通過對宿主植物根部進行品紅染色,利用倒置熒光顯微鏡對植物根圍的菌絲體及AM真菌侵染率的觀察,確定在紫穗槐出苗后15d菌絲體開始出現(xiàn)分枝,共生體進入初始信號識別階段,對此時土壤中根部和菌物分泌物進行收集：分別取出100g(AM-+Rh-、AM+、AM++Rh+)植株根際土壤,用500mL80%的乙醇進行溶解,將混合物放入70℃的恒溫水浴鍋中,充分溶解3h,使土壤中的信號物質(zhì)充分溶解,將上層液體用化學(xué)分析定性濾紙進行過濾,并將所得的濾液用0.22μm微孔濾膜抽濾(微孔濾膜提前1d在70℃水浴鍋中放置24h),保留抽濾液,再將抽濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40℃下由500mL濃縮至10mL,放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用毛細管法對AM真菌與根瘤菌之間趨化性進行研究：分別取AM-+Rh-、AM+和AM++Rh+處理的苗木根圍分泌物,在超凈臺內(nèi)利用細菌濾器進行滅菌處理;取試驗用的根瘤菌菌株,在滅菌玻璃容器內(nèi)制備根瘤菌懸浮液;將毛細吸管內(nèi)裝滿根系分泌物,用毛細微管方法測定根瘤菌對接種和非接種AM真菌苗木根部分泌物的趨化性。毛細管法：將毛細管(5cm)5個一束連接在一起,讓毛細管一端浸入土壤提取液中(AM-+Rh-、AM+、AM++Rh+),待浸滿根系分泌物后將另一端浸入石蠟中,封口;用微量移液器取13mL根瘤菌菌液(600nm,0.764)放入滅菌后的試管中,將毛細管束放入試管中,封口端露出液面2cm,然后加塞,并用石蠟將試管開口端封閉。分別放置在適宜根瘤菌生長的25℃、28℃、31℃條件下,待測。隨后,隔兩天對毛細管中的根瘤菌數(shù)目進行活菌計數(shù),利用活菌計數(shù)法對AM與根瘤菌間趨化現(xiàn)象進行定量測定：取出一組AM-+Rh-、AM+、AM++Rh+試管對照品,分別將毛細管取出,用無菌水將毛細管外壁菌液沖洗干凈;然后在滅菌后的研缽中將毛細管打碎研磨,用無菌水沖洗研缽后并將其定容至100mL的容量瓶中,進行梯度稀釋至10-2濃度,吸取10-2濃度稀釋液0.2mL于YMA培養(yǎng)基(甘露醇10g、酵母粉3g、磷酸氫二鉀0.25g、磷酸二氫鉀0.25g、蒸餾水1000mL、pH值6.8～7.2)上,涂布均勻后將培養(yǎng)皿倒置放入28℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。1.3處理數(shù)據(jù)對獲得的數(shù)據(jù)采用SPSSversion10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2.1am真菌和根瘤菌對主要控制的感染順序、根侵蝕率和根腫瘤變化2.1.1植株根系及菌根原理在播種后15周內(nèi),AM-+Rh-、Rh+、AM+和AM++Rh+四種處理條件下,都沒有出現(xiàn)根瘤;在第16周,AM++Rh+的處理條件下紫穗槐植株根部首先出現(xiàn)根瘤;在第19周,Rh+處理條件下的紫穗槐植物根部出現(xiàn)根瘤,其間AM+和AM-+Rh-處理條件下的植株根部都沒有根瘤生成;同時發(fā)現(xiàn)AM真菌在AM+情況下要比AM++Rh+情況下先侵染宿主植物,其菌根形成先后順序：AM+→AM++Rh+;在第9周后AM++Rh+的菌根侵染率增加,顯著高于AM+的菌根侵染率。實驗中AM-+Rh-處理沒有出現(xiàn)根瘤及菌根侵染情況,表明土壤基質(zhì)滅菌徹底,沒有殘留土著AM真菌和根瘤菌。2.1.2am+和rh+不同濃度的菌根初始感染率制作根切片鏡檢,根據(jù)Trouvelot法計算出不同時間條件下單接種(AM+)、雙接種(AM++Rh+)兩種情況下AM真菌對宿主植物的菌根侵染率變化。從圖1可以看出：在9周內(nèi)AM++Rh+的菌根侵染率要略低于AM+種的菌根侵染率;但在第9周至第15周之間AM++Rh+的菌根侵染率增加,顯著高于AM+種的菌根侵染率?？梢?在雙接種(AM++Rh+)的情況下,可以明顯促進其宿主植物的菌根侵染率由此可以推測,在AM真菌和根瘤菌之間存在著識別互動的作用過程,識別后二者間可產(chǎn)生協(xié)同增效作用。2.2am真菌與根瘤菌的相互作用利用毛細微管法測定AM-+Rh-、AM+和AM++Rh+苗木的根部提取物對根瘤菌的趨化性,將3種處理條件下的趨化實驗裝置分別置于不同溫度(25℃、28℃、31℃)條件下,在不同時間分別進行根瘤菌菌落數(shù)的定量測定。由圖2、3、4可知,25℃、28℃和31℃的AM++Rh+處理條件下,在試驗初期對根瘤菌的誘導(dǎo)效果要略低于AM+和AM-+Rh-的處理,但在9d左右其誘導(dǎo)效果開始高于AM+,在21d左右AM+和AM++Rh+根瘤菌數(shù)都在達到最大值后逐步趨于穩(wěn)定,且都顯著高于AM-+Rh-的處理。進一步表明,在AM真菌與根瘤菌之間確實存在著相互作用,彼此間有一個識別互動過程。從表1中數(shù)據(jù)可以看出,在31℃的處理條件下,單接種AM真菌(AM+)、雙接種(AM++Rh+)兩種情況的菌落數(shù)與25℃處理條件下的菌落數(shù)在不同時期取樣測定的結(jié)果表現(xiàn)出的差異不明顯;而在28℃的處理條件下,在第9天后這兩種情況的菌落數(shù)都顯著多于在25℃和31℃處理條件下的菌落數(shù),且在28℃處理條件下(AM+、AM++Rh+)對根瘤菌的誘導(dǎo)性要分別先于25℃和31℃處理條件下(AM+、AM++Rh+)對根瘤菌的誘導(dǎo)性。這表明外界溫度對AM真菌-宿主植物-根瘤菌三者共生體初始識別信號的調(diào)控也起到一定的作用。3am真菌和根瘤菌間的信號物質(zhì)及趨化特性試驗過程中采用根部微生物趨化試驗手段,對毛細管法作了進一步的完善,得到了一套簡便、適用的信號物質(zhì)和趨化性研究的方法,對AM真菌作用下根系分泌物對根瘤菌的趨化性進行體外驗證。根據(jù)實驗結(jié)果可以推測在AM真菌-宿主植物-根瘤菌共生體系建立期間,AM真菌與根瘤菌之間可能存在著一定的信號物質(zhì),彼此之間有一個識別互動過程,在識別前,兩種菌物彼此之間存在著拮抗作用;而在識別后,二者開始產(chǎn)生協(xié)同促進作用;在不同接種條件下,AM真菌分泌物對宿主植物根瘤的形成具有促進作用,對根瘤菌呈現(xiàn)正趨化作用。而Oldroyd和Endre等在相關(guān)的研究中也發(fā)現(xiàn),結(jié)瘤因子誘導(dǎo)信號途徑與由AM真菌所分泌的信號分子誘導(dǎo)途徑是部分共享的,根瘤菌可以感知由AM真菌所分泌的信號分子的存在,且接種AM真菌的植株根瘤數(shù)要多于不接種AM真菌處理AM真菌對根瘤菌侵染植物有促進作用;同時也發(fā)現(xiàn)不僅僅是環(huán)境中的pH值對結(jié)瘤因子及共生體的建立有著顯著的影響,外界溫度對二者間的信號識別過程也可能有一定的調(diào)控作用,本研究結(jié)果進一步證實了這一推論(圖2、3、4及表1)。本實驗只是對AM真菌與根瘤菌之間的信號物質(zhì)以及趨化特性進行了初步的研究,證實了二者間