第09章 基因工程和基因組學(xué)

第九章基因工程和基因組學(xué)1971年，Smith等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時代的開始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來

得到新的DNA分子。1973年，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Cohen教授及其同事把抗四環(huán)素基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA后，組成一個重組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一個重組DNA能在大腸桿菌中復(fù)制,并具有抗四環(huán)素遺傳表型。StanleyN.Cohen1974年,Cohen教授和加州大學(xué)的Boyer教授，將非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因得到表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)說明，經(jīng)DNA重組后的外源基因可在宿主體內(nèi)成功表達(dá)。HerbertW.Boyer1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的2550萬畝發(fā)展到2009年的20億畝，14年間增長了79倍。19961997199819992000200120022006200720082009廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程及酶工程等。狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術(shù))。

一、基因工程概述:第一節(jié)基因工程１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式,按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，借助于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去，使后者定向獲得新遺傳性狀的一門技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的建立，使所有實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的變革?；蚬こ淌遣捎梅肿由飳W(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來的綜合技術(shù)。

切接轉(zhuǎn)增檢2．基因工程操作過程：3．內(nèi)容：①從細(xì)胞和組織中分離DNA；②限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③

將酶切DNA分子與載體DNA連接

構(gòu)建能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的重組DNA分子；④

把重組DNA分子引入宿主受體細(xì)胞

復(fù)制；⑤

重組DNA隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞

建立無性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個體；⑥

從宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子；⑦

使外源基因在受體細(xì)胞中正常表達(dá)，翻譯成蛋白質(zhì)并分離、鑒定基因產(chǎn)物。目的基因載體轉(zhuǎn)化與鑒定內(nèi)切酶重組DNA表達(dá)一般而言，一個基因

是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段，包括啟動子、終止子及內(nèi)含子等。在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細(xì)胞中最難分析的大分子。DNA重組技術(shù)發(fā)展成功之后，DNA已成為細(xì)胞中最易操作分析的大分子。二、基因的分離與鑒定利用這一技術(shù)，可從一個含有10萬個基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個目的基因。㈠從基因庫中分離基因：1.構(gòu)建基因庫（library）基因庫是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。根據(jù)克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等。①核基因庫：核基因庫(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。理想的核基因庫應(yīng)能包括全部基因組序列。構(gòu)建文庫可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，收集所有菌落。噬菌體或(柯斯質(zhì)粒)載體：重組DNA包裝進(jìn)噬菌體，感染細(xì)菌，收集噬菌斑。BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體，導(dǎo)入相應(yīng)宿主細(xì)胞，收集所有細(xì)胞，即為基因庫。②染色體基因庫：將基因組的一部分如一條染色體用來構(gòu)建基因庫

可選擇特異基因以及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織。果蠅的多線染色體中，對染色體進(jìn)行微切割，構(gòu)建染色體區(qū)段基因文庫。如對X染色體上多線染色體帶的分析。人類基因組項(xiàng)目研究中，利用流動細(xì)胞分離(flowcytometry)技術(shù)將人類染色體分開，用于構(gòu)建單個染色體基因庫，大大加速了人類基因組作圖和分析。流式細(xì)胞分離原理酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldgelelectro–phoresis,PFGE)，將酵母菌16根染色體據(jù)其分子量大小分開后，用于構(gòu)建染色體庫，在基因組分析中發(fā)揮作用。③cDNA庫：以mRNA為模板

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA

構(gòu)建基因庫。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T為引物與多聚A互補(bǔ)配對，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，即可獲得cDNA第一鏈。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列

得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補(bǔ)齊后

以帶有限制性酶切點(diǎn)的人工接頭連接

酶切后與載體(通常是噬菌體)連接

制備cDNA庫。mRNA1.cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs2.cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPs

cDNA庫與核DNA庫不同：cDNA庫僅具有細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)基因的mRNA序列

僅包括基因組的部分基因序列。

cDNA庫對于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。

通常是將cDNA庫與核基因庫配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。2.篩選基因庫：根據(jù)待選基因相關(guān)信息

確定篩選方法和條件

從基因庫中篩選、分離基因；常用的基因庫篩選方法有表型篩選法、雜交篩選法、混合池PCR篩選法、差減雜交法、圖位克隆法、酵母雙雜交法等；多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針

篩選基因庫。密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆文庫篩選流程篩庫過程：將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后菌落印影在濾膜上

用堿裂解、中和后洗滌烘干

再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影

凡黑點(diǎn)菌落即為陽性克隆。影印洗滌雜交感光①.限制性酶圖譜：構(gòu)建陽性克隆的限制性酶圖譜

根據(jù)同源性分析，可了解陽性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對位置

用于進(jìn)一步亞克隆或同已知的其它序列比較。(二)陽性克隆的分析與鑒定：從基因庫中篩選出的陽性克隆

分析、鑒定

得到目的基因。限制性酶圖譜構(gòu)建方法(15kb)將陽性克隆DNA分裝3個管中

酶切DNA

瓊脂糖凝膠電泳

溴化乙錠染色

紫外燈下見到DNA帶。

從凝膠電泳結(jié)果分析：模式Ⅱ就是這個15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜。用類似的方法，將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長度的多型性

來分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標(biāo)記進(jìn)行基因組圖譜分析。②.核酸分子雜交：Southern雜交分析：由英國的Southern發(fā)明(1975)，一種將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜

進(jìn)行DNA分子雜交分析的方法。篩選基因庫得到陽性克隆后

將限制性酶酶切與Southern雜交結(jié)合

繪制限制性酶圖譜。Northern雜交分析：用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，檢測mRNA的存在。原理和程序與Sorthern雜交相同。Western雜交分析：用于蛋白質(zhì)的分析。③.核酸序列測定克隆后的DNA片段進(jìn)行核酸序列測定后

確定該DNA片段序列的正確性。一般采用Sanger(1977)發(fā)明的雙脫氧核糖核酸終止法測定核酸序列。CGCTCAGCTGGTGATTGTGT55333

-5

磷酸二酯鍵在Sanger雙脫氧法中，可用熒光標(biāo)記來代替放射性標(biāo)記：④.核酸序列分析：測定的核酸序列為何基因、有什么功能，需用計(jì)算機(jī)軟件或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。（1）同源性比較將待測序列在核酸和蛋白質(zhì)兩個水平上比較基因間的同源性，將序列發(fā)送到Genbank等DNAData數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫,網(wǎng)址：http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;Genbank,為設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫,網(wǎng)址：;Swissport/TREMBL網(wǎng)址：/sprot

對于那些同已知序列無任何同源性的新序列，可能還要進(jìn)行基因功能性研究。一個ORF是一條能編碼一條多肽鏈的DNA序列，具有翻譯起始信號和終止信號等。（2）分析核酸序列的閱讀框架

GmMYBZ2ORF：744bp247aaMYB-DNAbinding1:13-63aaMYB-DNAbinding2:65-114aa具有轉(zhuǎn)錄抑制作用的保守基序：pdLNLD/ELXiG/S

GmMYBZ2空間結(jié)構(gòu)預(yù)測（CHPmodels-2.0服務(wù)器）GmMYBZ2蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測紅色：a-螺旋；藍(lán)色：b-折疊；白色：無規(guī)卷曲

（三）PCR擴(kuò)增基因：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainReaction,PCR)可以體外快速擴(kuò)增DNA。美國Mullis(1986)發(fā)明，是現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的一個里程碑。PCR技術(shù)是以DNA互補(bǔ)鏈的聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過DNA變性、引物與模板DNA一側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性雜交，由DNA聚合酶催化引物延伸，最終獲得特異DNA片段的體外擴(kuò)增方法。DNA模板變性退火延伸循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2RF1324變性退火延伸循環(huán)31234基本要素模板：待拷貝的DNA,可以是雙鏈,也可是單鏈DNA；引物：引導(dǎo)DNA的合成。在PCR擴(kuò)增中一般使用合成的寡核苷酸作引物；DNA聚合酶：DNA復(fù)制的動力，在dNTP等底物存在時在引物的引導(dǎo)下沿著模板DNA合成互補(bǔ)的DNA鏈。dNTP：DNA合成的底物。使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。（四）人工合成基因：根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來

可很快地人工合成基因。如SOE-PCR(splicingbyusingoverlappedextension)技術(shù)

可擴(kuò)增出完整的基因序列?；瘜W(xué)合成的寡聚核苷酸(80-100個核苷酸)

通過SOE將單鏈部分補(bǔ)齊；2.PCR擴(kuò)增DNA片段；3.DNA變性；4.兩個單鏈部分經(jīng)SOE補(bǔ)齊

雙鏈；5.PCR擴(kuò)增DNA，利用多級SOE-PCR擴(kuò)增出完整的基因。1.限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme)：一類能識別雙鏈DNA分子中一段特定的核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。

三、限制性內(nèi)切核酸酶2.限制性內(nèi)切酶的命名：用屬名的第一個字母和種名的前兩個字母，組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名稱;如：大腸桿菌(Escherichiacoli)

用Eco表示；流感嗜血菌(Haemophilus

influenzae)

用Hin表示。用一個寫在右下方的字母代表菌株或類型；如EcoK，Hind。用羅馬數(shù)字表示不同的限制和修飾體系，如：HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等。3.限制性內(nèi)切酶的類別：第Ⅰ類酶:每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性,酶切位點(diǎn)不定。

第Ⅱ類酶:能識別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅲ類酶:能識別位點(diǎn)分別是AGACC和CAGCAG,切割位點(diǎn)則在下游24-26bp處。4.第Ⅱ類核酸內(nèi)切酶特性：在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂；靶序列：具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)的回文序列；ABCC′B′A′ABCC′B′A′ABNB′ABN′B′A′A′回文序列(palindrome)：從兩個方向閱讀而序列相同的序列。對靶序列的切割：(1)

產(chǎn)生平末端(bluntend)的切割如SmaⅠ：兩條鏈上的斷裂位置處于一個對稱結(jié)構(gòu)的中心。(2)產(chǎn)生粘性末端(stickyend)的切割兩條鏈上的斷裂位置是交錯的、但又是對稱地圍繞一個對稱軸排列。如EcoRⅠ：粘性末端:

DNA分子在限制性內(nèi)切酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)。同裂酶:來源不同但可識別相同核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割并形成同樣末端的限制酶。如HpaⅡ和MspⅠ均可識別CCGG。同尾酶:來源不同，識別的靶序列也各不相同，但都能產(chǎn)生同樣粘性末端的限制酶。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCA載體：將“目的”基因?qū)胧荏w細(xì)胞的運(yùn)載工具。

DNA片段與適合的載體DNA連接構(gòu)成重組DNA

在載體DNA的運(yùn)載下，高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行復(fù)制。DNA載體：質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒DNA、細(xì)菌或酵母菌人工染色體等。四、載體（vector）：載體的條件：①具有復(fù)制原點(diǎn)，能自我復(fù)制；②具有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite，MCS)即有多種限制酶的切點(diǎn)；③具有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因；④易從宿主細(xì)胞中回收。（一）細(xì)菌質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈

DNA分子。質(zhì)粒具有重組表型檢測標(biāo)記，檢測是否攜帶外源DNA片段。在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制程度：嚴(yán)緊型：一個細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)量有1-2個；

松馳型：每個細(xì)胞內(nèi)有的20-60個。pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：③多克隆位點(diǎn)中的酶切位點(diǎn)多，克隆方便；④具有a－互補(bǔ)的顯色表型，用于檢測重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記。①分子量小，可接受較大外源片段(10Kb)；②拷貝數(shù)多，每個細(xì)胞中有500個；a-互補(bǔ)：指來自細(xì)菌DNA的b-半乳糖苷酶(lacZ)N端的一段氨基酸殘基(a-肽)，在與a-肽缺失的b-半乳糖苷酶混合后，能夠回復(fù)lacZ酶活性的一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象?；蚪M全長49kb。噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。中間基因簇可被外源DNA替代而不影響浸染細(xì)菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作為cDNA或核DNA克隆的載體。（二）λ噬菌體(溫和型)：

優(yōu)點(diǎn)：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基因進(jìn)入細(xì)胞并增殖；1.攜帶大片段外源DNA分子，可占用總量的25%時仍不失活。（三）柯斯質(zhì)粒(cosmid)：部分λ噬菌體DNA+部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建

柯斯質(zhì)粒。帶有噬菌體cos序列和細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)、抗生素抗性標(biāo)記。這種質(zhì)粒分子量較小，但可接受長達(dá)50kb的外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用?！咭粋€長片段DNA可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。（四）細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC載體可以攜帶大于50kb的外源DNA片段。

特點(diǎn)：帶有外源DNA的BAC載體在細(xì)胞中是單拷貝的；載體本身分子量很小(7.4kb)；選擇標(biāo)記：氯霉素抗性基因；

多克隆位點(diǎn)位于lacZ基因內(nèi)。F因子經(jīng)基因工程改造成BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。（五）酵母人工染色體(YAC)：YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)和可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因；還具有酵母菌染色體一些特點(diǎn)；可接受100-1000kb的外源DNA片段。YAC已成為人類基因組計(jì)劃和圖位克隆基因的重要工具；并促進(jìn)了人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。1996年完成了酵母菌全基因組序列的測定指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。如能在原核生物（如E.coli）、真核細(xì)胞（如酵母）中復(fù)制的載體。穿梭載體需同時具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)、真核生物自主復(fù)制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及兩者的選擇標(biāo)記。（六）穿梭載體(shuttlevectors):穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。

酵母菌的YEp(yeast

episomaplasmid)和YRp系列載體均是穿梭載體。穿梭質(zhì)粒YEp24

pCAMBIA2301載體（七）Ti質(zhì)粒及其衍生載體：適合于植物的載體系統(tǒng)

將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞并使目的基因表達(dá)。Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌(革蘭氏陰性菌)(Agrobacterium

tumefaciens)細(xì)胞中

可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞(tumor-Inducing

Ti)

冠癭瘤(growngalltumors)。Ti質(zhì)粒一部分DNA叫轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA，T-DNA)，當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物時，T-DNA便轉(zhuǎn)移到植物的染色體上，誘導(dǎo)冠癭瘤，并能合成冠癭堿(opine),作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源。農(nóng)桿菌感染產(chǎn)生冠纓瘤目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技術(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域，為人類創(chuàng)造了巨大的財富。五、基因工程的應(yīng)用具有生長激素的轉(zhuǎn)基因鼠㈠基因工程工業(yè)

最早應(yīng)用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細(xì)菌中表達(dá)人的胰島素(1982)。

胰島素是一種控制糖代謝的蛋白質(zhì)激素。不能產(chǎn)生胰島素的患者會有糖尿病，患者必須每天注射胰島素。

現(xiàn)已在細(xì)菌中生產(chǎn)10多種醫(yī)藥產(chǎn)品，如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。胰島素的人工生產(chǎn)

有些真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)需要糖基化等修飾加工以后才具有活性，而細(xì)菌細(xì)胞缺少真核細(xì)胞的這些修飾系統(tǒng)

真核生物細(xì)胞更適合于表達(dá)真核生物蛋白質(zhì)基因。

目前，酵母菌、植物懸浮細(xì)胞、植株和動物培養(yǎng)細(xì)胞成功地均應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白。基因工程應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長激素（二）植物基因工程

植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞被內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的過程。基因轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最多。1.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是應(yīng)用的最早最廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法（雙子葉植物、單子葉植物）。過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子；插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒；再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細(xì)胞；將重組農(nóng)桿菌去感染植物細(xì)胞（組織）；使Ti質(zhì)粒的部分DNA（攜帶目的基因），整合到植物染色體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合成酶）基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。基因槍法植物轉(zhuǎn)化是通過高壓氣體為動力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒

將目的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，并整合到染色體上的方法。2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)：轉(zhuǎn)化的載體多數(shù)是以pUC系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的。它們通常具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)及抗性選擇標(biāo)記，具有可在植物中表達(dá)的啟動子終止子及調(diào)控序列，以及植物抗性選擇標(biāo)記(如除草劑、潮霉素等抗性)。

幾種基因槍類型的共同特點(diǎn)：是用一種動力系統(tǒng)將包被DNA的金屬微粒導(dǎo)入受體細(xì)胞或組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化。1.位于高壓氣體桶底部的爆破片；2.載有重組DNA和金屬微粒的微彈載體；3.阻攔網(wǎng)；

4.

包裹有重組DNA的金屬微粒；5.被轟擊樣品。㈢轉(zhuǎn)基因動物:與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展要慢些。這主要涉及到一些技術(shù)難題，以及倫理學(xué)、宗教等問題。轉(zhuǎn)基因動物：將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動物受體細(xì)胞基因組中，從而形成在體表達(dá)外源基因的動物，稱為轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物是如何獲得的呢？受體細(xì)胞的準(zhǔn)備受精卵：注射促性腺激素，使動物超數(shù)排卵，從而收集、獲得合適的受精卵；胚胎干細(xì)胞：從早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離獲得具有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性的細(xì)胞。基因的準(zhǔn)備線形DNA或環(huán)形DNA均可，但線形DNA整合率要高于環(huán)形DNA；環(huán)形DNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較長，使用于瞬時表達(dá)和基因治療?；虻霓D(zhuǎn)化利用顯微注射法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中；通過篩選基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子；陽性轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至囊胚期；胚胎移植胚胎移植：將供體的受精卵或早期胚胎，移植到同種的生理狀態(tài)相同的其他受體體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體的技術(shù)，也稱作借腹懷胎。轉(zhuǎn)基因個體的鑒定對代孕母獸產(chǎn)下的幼獸進(jìn)行相關(guān)分子鑒定，首先，檢測目的基因是否整合到了受體的基因組中；其次，檢測目的基因是否表達(dá)；最后進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的分離純化及生物活性檢測。卵細(xì)胞的獲得費(fèi)時費(fèi)力；很多人認(rèn)為，從胚胎中收集胚胎干細(xì)胞是不道德的，因?yàn)閯游锏纳鼪]有得到珍重，動物的胚胎也是生命的一種形式，無論目的如何高尚，破壞胚胎是不可想象的；動物的體細(xì)胞是否可以作為轉(zhuǎn)基因的受體細(xì)胞呢？生物學(xué)家一度認(rèn)為，由一個成熟的動物細(xì)胞“無性繁殖”成一個子體是不可能的。1997年，克隆羊“多莉”的誕生，徹底打破了這種不可能性，并立即引起世界的震驚和媒體的關(guān)注?？寺⊙颉岸嗬颉钡恼Q生300個277個29個1只乳汁中含有α抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因羊各種克隆動物相繼誕生1997年，夏威夷科學(xué)家從成年小老鼠的細(xì)胞復(fù)制出第一只克隆小老鼠，名叫Cumulina。Cumulina兩歲零七個月死亡,這是一個比較正常的死亡年齡，比普通老鼠的平均壽命長7個月。它曾經(jīng)生產(chǎn)了兩次。1998年日本科學(xué)家用子宮和輸卵管細(xì)胞成功克隆牛,首兩頭克隆牛分別名為“KAGA一號”和“NOTO一號”之后，日本復(fù)制出了數(shù)千克隆牛。出生于一九九八年八月的克隆?！癒AGA二號”產(chǎn)下了小牛。世界上第一批三只克隆山羊已由美國一家生物公司于1998年“制造”出來?？寺∩窖騇ira和她的姐妹們都來自美國的實(shí)驗(yàn)室，它們生產(chǎn)含有人類抗凝血酶-3的羊奶?？鼓?3是血液天然含有的蛋白質(zhì)，其功能是協(xié)助控制血凝。2000年，科學(xué)家從兩頭分別死亡將近18小時和24小時的雌盤羊卵巢內(nèi)取出DNA，將其注入盤羊的“近親”――普通白羊的卵細(xì)胞內(nèi)，克隆出了一只摩弗倫羊（又稱歐洲盤羊）。這是世界上首次把克隆技術(shù)應(yīng)用于一種瀕臨滅絕的哺乳類動物身上。2003年5月29日，一頭名叫“愛達(dá)荷寶石”的克隆騾子在美國愛達(dá)荷大學(xué)（UniversityofIdaho）與公眾見面2005年韓國科學(xué)家培育出世界首只克隆狗“斯納皮(Snuppy)”2005年10月意大利著名的克雷莫納繁殖技術(shù)研究中心成功地克隆出了14只小豬仔2006年11月美國維亞金公司宣布成功克隆出純種賽馬“克萊頓”我國體細(xì)胞克隆牛"康康"，在萊陽農(nóng)學(xué)院動物胚胎工程中心西北農(nóng)林科技大學(xué)克隆山羊山東曹縣五里墩中大動物胚胎工程中心人類生長激素轉(zhuǎn)基因豬同胞鼠對照轉(zhuǎn)移有人類生長激素轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因熒光豬㈣遺傳疾病診斷：利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進(jìn)行診斷

準(zhǔn)確度高，速度快。進(jìn)行產(chǎn)前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。b-球蛋白基因MstⅡ酶切結(jié)果㈤基因治療：利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者的基因組中

治療遺傳疾病，通常叫做基因治療(genetherapy)。方法：利用減毒的病毒DNA作載體(retrovirusDNA)

構(gòu)建重組DNA分子

用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細(xì)胞

將正?；蛘系饺旧w上。例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus載體，已用于治療嚴(yán)重綜合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脫氫酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起的，患者無任何免疫功能。2000年法國Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的兩個嬰兒（8個月和11個月）。這一工作被認(rèn)為是20世紀(jì)人類基因治療上的重大突破。方法：將ADA基因?qū)氲組LVretrovirus

載體中

取代該病毒DNA中的三個結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env)

將重組后的病毒去感染T細(xì)胞，使ADA基因整合到T細(xì)胞的染色體中

實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。核酸分子雜交的原理和方法+半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合

發(fā)展形成的一門新技術(shù)。這一技術(shù)可使許多分子雜交反應(yīng)同時進(jìn)行。

DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龍等。㈥DNA芯片(DNAchips)在面積不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地點(diǎn)陣排列于一定位置的、可尋址的核苷酸分子；將待分析核苷酸分子標(biāo)記(如用熒光)，變性成單鏈與芯片上序列相同的核苷酸分子雜交；與芯片上序列不同的核酸分子被洗掉；利用高精度的激光掃描儀記錄分子已雜交的熒光信號；計(jì)算機(jī)軟件分析?；蚨鄳B(tài)性檢測（如單核苷酸多態(tài)性篩選

singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表達(dá)分析(不同細(xì)胞和不同組織的RNA群體比較)；

克隆選擇及文庫篩選（如cDNA文庫）；基因突變檢測及遺傳病和腫瘤的診斷等。DNA芯片技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：用基因芯片預(yù)測“未病之病”

通過基因芯片靈敏快速的檢測癌基因及正?；虻谋磉_(dá)變化,從而實(shí)現(xiàn)中國古語中“上醫(yī)治未病”的理想,對疾病作出前瞻性的診斷,這就是“基因診斷”第二節(jié)基因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)：研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物、醫(yī)學(xué)、和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。研究對象：以整個基因組為研究單位，而不以單個基因?yàn)閱挝蛔鳛檠芯繉ο?。研究目?biāo)：認(rèn)識基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化；

闡明整個基因組所包含的遺傳信息和相互關(guān)系；

充分利用有效資源，預(yù)防和治療人類疾病。重要組成部分：基因組計(jì)劃(genomeproject)大體上可分為：⒈構(gòu)建基因組的遺傳圖譜；⒉構(gòu)建基因組的物理圖譜；⒊測定基因組DNA的全部序列；⒋繪制基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；⒌分析基因組的功能。基因組計(jì)劃研究開始于1990年。

美國啟動被譽(yù)為“人體阿波羅計(jì)劃”的“人類基因組計(jì)劃”，投資30億美元，歷時15年

測定人類基因組的30億個核苷酸對的排列次序

構(gòu)建高分辨率的人類基因組遺傳圖譜和物理圖譜

發(fā)展生物信息學(xué)。人類基因組計(jì)劃在美國提出人類基因組計(jì)劃后，日本和中國分別于1991年和1992年啟動了“水稻基因組計(jì)劃”。由于以人類為對象的研究實(shí)際上受到諸多限制，也受倫理學(xué)的約束，所以人類基因組計(jì)劃還將對有關(guān)的模式生物，如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥等進(jìn)行相應(yīng)的研究，為研究人類基因組的戰(zhàn)略提供重要的依據(jù)。2002年4月5日《Science》以14頁的篇幅刊登和宣布中國科學(xué)家獨(dú)立繪制完成水稻基因組草圖序列(總