蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望

蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的最終控制和直接執(zhí)行者。它參與了大多數(shù)生物生命活動(dòng)的過程，如生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳、代謝、激酶、循環(huán)、信號(hào)傳達(dá)等。100多年來(lái),特別是20世紀(jì)生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,如氨基酸序列測(cè)定、多肽合成技術(shù)、X射線衍射技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)等,使人們認(rèn)識(shí)到,蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)和功能高度多樣,并能對(duì)環(huán)境各種刺激做出自發(fā)響應(yīng)的、復(fù)雜而神奇的“網(wǎng)絡(luò)生命大分子”。隨著后基因組時(shí)代(post-genomeera)的到來(lái),科學(xué)家們的研究重心已經(jīng)從解釋生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對(duì)生物功能的研究。采用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR、基因表達(dá)系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、DNA芯片等技術(shù)從基因水平上闡述生命活動(dòng)規(guī)律,其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平,但事實(shí)并非如此。從DNA到蛋白質(zhì),存在3個(gè)層次的調(diào)控,即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(transcriptionalcontrol),翻譯水平調(diào)控(translationalcontrol),翻譯后水平調(diào)控(post-translationalcontrol)。從mRNA角度考慮,實(shí)際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,并不能全面代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的最終體現(xiàn)者,有其自身固有的特點(diǎn),如蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、構(gòu)象變化、亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)間相互作用等,這些都無(wú)法在基因水平上找到答案。因此,要想真正揭開生命現(xiàn)象的奧秘,必須進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的功能研究。在不同生理或病理狀態(tài)下,篩選鑒定出某些已知或未知的蛋白質(zhì)后,必須回答蛋白在生物體內(nèi)的生物學(xué)功能到底是什么,是什么樣的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)使得蛋白質(zhì)分子能夠發(fā)揮其特定生物學(xué)功能,其分子調(diào)控機(jī)制是怎樣的等問題。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)功能研究習(xí)慣于將待研究的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取分離和純化,進(jìn)而分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性,但很多情況下這樣的研究方法無(wú)法揭示某種蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的功能往往是通過與其他分子的特異相互作用而共同實(shí)現(xiàn)的,并非單獨(dú)發(fā)揮作用的。近年來(lái),蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)和方法已經(jīng)得到迅速發(fā)展,大量文章都涉及某些蛋白質(zhì)功能方面的研究,但是對(duì)蛋白質(zhì)功能研究方法進(jìn)行系統(tǒng)綜述的文章非常少,因此,試圖對(duì)目前蛋白質(zhì)功能研究方法和技術(shù)及其最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1-de與雙熒光差異凝膠電泳蛋白質(zhì)組學(xué)(proteome)目前被廣泛應(yīng)用于尋找大量新型生物標(biāo)記物和藥物治療靶點(diǎn),為闡明蛋白質(zhì)功能、疾病機(jī)制及疾病治療提供依據(jù)。研究蛋白質(zhì)表達(dá)譜的技術(shù)路線主要有兩條,一條是傳統(tǒng)的基于凝膠電泳(gel-based)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜技術(shù),如雙向凝膠電泳(twodimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、雙向熒光差異凝膠電泳(twodimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)。2-DE技術(shù)雖然傳統(tǒng)而“古老”,但由于其高分辨率和高通量的特點(diǎn),仍然是非常有效而且關(guān)鍵的蛋白質(zhì)分離技術(shù),特別是在比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。另一條是基于非膠體系的多維液相層析分離與生物質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)路線(MudPIT-LC-MS),其特點(diǎn)是高通量、速度快,克服了2-DE不能很好顯示低豐度、疏水性、偏堿性、極大和極小蛋白的缺點(diǎn)。目前我國(guó)已建立了具有國(guó)際先進(jìn)水平的、高通量、高靈敏的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái),并且成功開展了有關(guān)人類重要生理及病理相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,如人胎肝的蛋白質(zhì)表達(dá)譜和磷酸化修飾譜、肺癌和肝癌差異蛋白質(zhì)組等研究。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鑒定出來(lái)的差異蛋白結(jié)果只是初步的,所以當(dāng)篩選鑒定出差異蛋白后,可從網(wǎng)上檢索該蛋白的相關(guān)信息和文獻(xiàn),選取比較有意義的特定蛋白進(jìn)行在細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證,并開展更為精細(xì)的后續(xù)功能的分析。2生命活動(dòng)基礎(chǔ)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)每個(gè)蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立發(fā)揮作用,通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成較大復(fù)合體,在特定的時(shí)間和空間內(nèi)行使特定的功能,構(gòu)成各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。目前,用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法非常多,包括酵母雙雜交技術(shù)、串聯(lián)親和純化技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)、表面胞質(zhì)團(tuán)共振技術(shù)、免疫共沉淀等等,作為一種好的蛋白質(zhì)相互作用方法,應(yīng)該具備兩個(gè)條件:(1)特異性,能鑒定出與目的蛋白特異作用的蛋白;(2)能反映在生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的相互作用。2.1轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem,Y2H)是由Field和Song在1989年研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)首次發(fā)明,是一種在酵母中利用轉(zhuǎn)錄激活物的重組來(lái)鑒定蛋白質(zhì)之間相互作用的方法,在蛋白質(zhì)相互作用方面扮演著重要角色。真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子具有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain),分別與誘餌蛋白及可能與誘餌蛋白相互作用的獵物蛋白相連,并共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。如果兩個(gè)蛋白能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來(lái)分開的兩部分結(jié)合,從而激活下游報(bào)告基因。通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物就可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用,如Wang等應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)人Polo樣激酶1(PLK1)與人乳頭瘤病毒5型(HVP-5)的E2蛋白是相互作用的。后來(lái)又有研究者在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行雙雜交。雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白分子間兩兩相互作用的傳統(tǒng)技術(shù),其假陽(yáng)性率和假陰性率比較高,所以必須與其他技術(shù)聯(lián)用加以鑒定。2.2核心靶點(diǎn)的選擇與鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽和tev蛋白分離的分子串聯(lián)親和純化(tandemaffinitypurification,TAP)是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù),與酵母雙雜交系統(tǒng)不同,此方法可在生理?xiàng)l件下研究多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的相互作用,兼具融合蛋白親和色譜法和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn),通過兩步特異性的親和純化可獲得與目的蛋白結(jié)合的高純度蛋白質(zhì)復(fù)合物。該方法首先對(duì)目的蛋白進(jìn)行TAP標(biāo)簽標(biāo)記,標(biāo)簽包括3個(gè)部分:蛋白A、鈣調(diào)素結(jié)合多肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)和中間連接的TEV酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)。在蛋白復(fù)合物的分離純化中,第一步利用與蛋白標(biāo)簽具有親和作用的色譜柱,采用TEV蛋白酶斷裂TEV蛋白酶切位點(diǎn)的方式洗脫;第二步利用與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽具有親和作用的鈣調(diào)蛋白色譜柱,將蛋白復(fù)合物和TEV蛋白酶分開,純化出的蛋白復(fù)合物用凝膠電泳、質(zhì)譜技術(shù)或Edman降解法進(jìn)行鑒定。TAP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是利用酶切的方法進(jìn)行洗脫,條件溫和,不破壞復(fù)合物的結(jié)構(gòu),并且經(jīng)兩步洗脫,去除了雜蛋白的干擾,提高了蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果的可靠性、特異性,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了酵母雙雜交傳統(tǒng)技術(shù)。2.3熒光標(biāo)記法檢測(cè)兩蛋白質(zhì)的相互作用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的基本原理是處于激活狀態(tài)的供體能在足夠近的距離(小于10nm)將本身的熒光傳遞到受體上。因此,用熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì),可以通過熒光體的能量傳遞來(lái)檢測(cè)兩蛋白質(zhì)的相互作用。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以在生理?xiàng)l件下無(wú)損傷、動(dòng)態(tài)地研究蛋白質(zhì)的相互作用,同時(shí)還能檢測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。但是,該方法受熒光發(fā)色基團(tuán)空間距離的限制,只能用于研究分子量小于200kD的蛋白。目前隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,很多研究者運(yùn)用計(jì)算分析和構(gòu)建相互作用模型的方法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用,從而發(fā)現(xiàn)更多未發(fā)現(xiàn)有相互作用的蛋白,但這些發(fā)現(xiàn)的蛋白需要利用以上提到的方法進(jìn)行鑒定。總之,用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法很多,所有方法都各有千秋,但至今尚無(wú)十分理想的方法可以大規(guī)模獲得蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù),故相互作用圖譜有賴于各種研究方法的綜合分析。3亞細(xì)胞定位的實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者,其功能與亞細(xì)胞定位密切相關(guān),有序分布和動(dòng)態(tài)調(diào)控的蛋白質(zhì)是保證生命個(gè)體實(shí)現(xiàn)其精細(xì)的生物功能的前提。特別是對(duì)于真核細(xì)胞來(lái)說(shuō),蛋白質(zhì)位于不同的亞細(xì)胞部位,其所行使的功能也不同,或者說(shuō)蛋白質(zhì)表達(dá)部位發(fā)生錯(cuò)誤就會(huì)失去預(yù)期的功能,從而對(duì)細(xì)胞乃至對(duì)整個(gè)機(jī)體產(chǎn)生影響。目前更是提出了定位組(1ocalizome)的概念來(lái)大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。觀察蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的精確定位可以借助各種顯微鏡技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)作為一種集激光、顯微鏡和計(jì)算機(jī)于一體的新型、高精度顯微鏡,是近十幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的大型生物學(xué)分析儀器,與其他顯微鏡相比,其功能強(qiáng)大,能進(jìn)行熒光定量測(cè)量、共焦圖像分析、三維圖像重建、活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè)、胞間通訊研究等,可對(duì)所觀察的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、定性、定位的監(jiān)測(cè),在整個(gè)細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。免疫電鏡技術(shù)(immunoelectronmicroscopy,IEM)是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究手段,集電子顯微技術(shù)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)于一體,能在細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)水平對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位。目前研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位已具備了多種成熟的方法,如融合報(bào)告基因定位法、免疫電鏡技術(shù)定位、免疫熒光定位和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)定位等。也有研究者提出可通過相互作用蛋白的亞細(xì)胞定位來(lái)檢測(cè)目的蛋白的定位,此種方法的關(guān)鍵在于選定可靠的,且與目的蛋白相互作用的蛋白。3.1gfp的熒光檢測(cè)融合報(bào)告基因定位法是將目的蛋白基因與易于檢測(cè)的報(bào)告基因進(jìn)行融合,構(gòu)建融合基因表達(dá)載體表達(dá)融合蛋白,然后借助于報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的特征來(lái)定位目的蛋白質(zhì)的一項(xiàng)技術(shù)。目前,報(bào)告基因就其表達(dá)產(chǎn)物而言,以綠色熒光蛋白(GFP)應(yīng)用最為廣泛,因?yàn)榫G色熒光蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量較小,發(fā)色基團(tuán)性質(zhì)穩(wěn)定,在與其它蛋白質(zhì)融合后發(fā)射熒光,同時(shí)不影響它所連接的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。利用這些特性結(jié)合顯微鏡技術(shù)(如激光掃描共聚焦顯微鏡),通過檢測(cè)GFP發(fā)射的熒光就可測(cè)定目的蛋白在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位。如Vartiainen等利用GFP和激光掃描共聚焦技術(shù)證實(shí)了血清應(yīng)答因子(SRF)的共激活劑MAL的亞細(xì)胞定位是受核內(nèi)肌動(dòng)蛋白的調(diào)控,Varecha等也通過GFP標(biāo)記技術(shù)分析了人細(xì)胞凋亡過程中凋亡蛋白核酸內(nèi)切酶G、AIF和AMID的細(xì)胞內(nèi)定位情況。3.2免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術(shù)方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術(shù)主要經(jīng)歷了鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)以及膠體金標(biāo)記技術(shù)3個(gè)主要發(fā)展階段。膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)因其具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)成為目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡標(biāo)記物,用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多種抗原的精確定位。將免疫細(xì)胞化學(xué)方法與電鏡技術(shù)聯(lián)用最大的優(yōu)點(diǎn)就是體內(nèi)定位系統(tǒng),反映的是活體狀態(tài)下目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置,是最直接、準(zhǔn)確的定位方法。如Hashimoto等利用原位雜交和免疫電鏡的研究證實(shí)人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞有過氧化物酶小體存在。但是,這種方法的先決條件是要求具備目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性的抗體,而這大部分蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)都是很難具備的條件。另外,免疫細(xì)胞化學(xué)方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),效率低,技術(shù)依賴性強(qiáng),難以實(shí)現(xiàn)高通量。4反向遺傳技術(shù)遺傳學(xué)手段大致可以分為“正向遺傳學(xué)”(forwardgenetics)和“反向遺傳學(xué)”(reversegenetics)兩類。正向遺傳學(xué)是分子遺傳學(xué)家最初可使用的一種方法,是指通過生物個(gè)體或細(xì)胞基因組的自發(fā)突變或人工誘變,尋找相關(guān)的表型或效應(yīng)改變,然后從這些特定效應(yīng)變化的個(gè)體或細(xì)胞中找到對(duì)應(yīng)的突變基因,并揭示其功能,例如遺傳病基因的克隆。反向遺傳學(xué)的原理正好相反,人們首先是改變某個(gè)特定的基因或蛋白質(zhì),然后再去尋找有關(guān)的表型或效應(yīng)變化,如基因敲除(knockout)、RNA干擾(RNAinterference,RNAi)等,這些技術(shù)目前已經(jīng)趨于成熟?；蚯贸m然是一種很有效的產(chǎn)生突變個(gè)體方法,但因其復(fù)雜而又費(fèi)時(shí),故不能被普遍接受。而自1998年Fire等發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象以來(lái),RNAi技術(shù)已被證實(shí)是一種特異、高效、經(jīng)濟(jì)的抑制基因表達(dá)的手段而受到極大的重視和歡迎。2001年,RNAi技術(shù)被成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,其應(yīng)用前景更加誘人。研究者們可以利用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性表達(dá)沉默,通過觀察其表達(dá)被抑制的細(xì)胞或者生物體的從形態(tài)到各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化,對(duì)該基因或蛋白質(zhì)的功能及參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。這比傳統(tǒng)的基因敲除方法要簡(jiǎn)單而且方便得多,因此短短幾年,就有了很多突破性的成果,其中研究得最多的是跟疾病相關(guān)的一些基因和蛋白,如Song等已經(jīng)成功地利用RNAi技術(shù)治愈了試驗(yàn)鼠的暴發(fā)性肝炎,Qin等報(bào)道,用siRNA沉默HIV的重要受體——chemokinereceptor5(CCR5)有效阻斷了HIV病毒對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的侵入。4.1磷酸腺苷作誘導(dǎo)沉降性因子RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后,在三磷酸腺苷(ATP)依賴性RNA酶Ⅲ(Dicer,DCR)的作用下被切割成3′端有2個(gè)突出堿基的21~23nt長(zhǎng)度的小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA);這些siRNA與RNAi特異性酶結(jié)合,形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC);而后RISC在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下與siRNA同源靶mRNA相結(jié)合,RISC中的重要組成成分Ago2蛋白在近中點(diǎn)位置將其切割,隨后靶mRNA被細(xì)胞內(nèi)RNA酶降解,轉(zhuǎn)錄后的mRNA就不能翻譯出相對(duì)應(yīng)的蛋白,而RISC游離出來(lái),尋找新的目標(biāo)分子,從而達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的作用,如圖1所示。4.2病毒載體誘導(dǎo)rnaisiRNA的制備主要有5種方法,包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄合成法、dsRNA法、siRNA表達(dá)載體和siRNA表達(dá)框架(表1)。從表1可以看出,要想建立長(zhǎng)效基因沉默的細(xì)胞株進(jìn)行功能缺失研究,只能采用siRNA表達(dá)載體方法,其它方法均為誘發(fā)瞬時(shí)基因沉默。siRNA表達(dá)載體方法是借助表達(dá)質(zhì)?；虮磉_(dá)病毒載體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA,使研究者無(wú)需直接操作RNA就可達(dá)到長(zhǎng)期抑制靶基因表達(dá)的目的,且載體上的抗性標(biāo)記有助于快速篩選出陽(yáng)性克隆,這使得其將具有更為廣闊的應(yīng)用前景,其中用病毒載體介導(dǎo)RNAi近年來(lái)受到人們重點(diǎn)關(guān)注,利用病毒載體能解決質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、效果不穩(wěn)定和某些類型細(xì)胞不能轉(zhuǎn)染等問題,擴(kuò)大了RNAi的應(yīng)用范圍。常見病毒載體有腺病毒(adenovirus)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)載體、慢病毒(lentivirus)載體等。最近慢病毒載體因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),逐漸成為表達(dá)載體中的大熱,與其它表達(dá)載體相比,最大的優(yōu)勢(shì)是它們能同時(shí)感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞,對(duì)干細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究,能解決轉(zhuǎn)染效率低的問題。如Kim等利用慢病毒載體抑制了間質(zhì)干細(xì)胞中的蛋白ICAT的表達(dá),通過與ICAT過表達(dá)組的比較,證實(shí)ICAT參與組織基質(zhì)細(xì)胞的增值和分化;Wiederschain等利用pLKO-Tet-OnshRNA慢病毒載體系統(tǒng)有效抑制了一系列癌細(xì)胞系中Bmi-1和Mel-18蛋白的表達(dá);Huang利用慢病毒載體高效抑制了蛋白Smad4在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá),并探討了Smad4在TGF-beta1誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞增值和凋亡過程中的作用。這些都說(shuō)明慢病毒載體是一個(gè)高效且快速的干擾系統(tǒng),如果能篩選出長(zhǎng)效穩(wěn)定基因沉默的細(xì)胞株,可以進(jìn)一步根據(jù)目的蛋白/目的基因或其家族的已知功能特性,通過干擾組與正常細(xì)胞組或蛋白過表達(dá)組的比較,開展各類細(xì)胞功能試驗(yàn)來(lái)鑒定目的蛋白的具體功能和調(diào)節(jié)機(jī)制,如細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、細(xì)胞侵襲試驗(yàn)、細(xì)胞中各類酶的測(cè)定、相關(guān)基因的表達(dá)、各項(xiàng)生理生化指標(biāo)變化檢測(cè)等。5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)生物信息學(xué)是通過實(shí)驗(yàn)手段認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)功能方法的補(bǔ)充,它是現(xiàn)代生命科學(xué)與信息科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等學(xué)科相互滲透而高度交叉形成的一門新興前沿學(xué)科。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能已成為后基因組時(shí)代的一項(xiàng)重要任務(wù),它貫穿蛋白質(zhì)功能研