發(fā)酵工業(yè)菌種選育 誘變育種

2.工業(yè)發(fā)酵菌種的選育2.2.2誘變育種誘變育種的定義

1.誘變育種的含義應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群,促進(jìn)其突變率大幅度提高,然后采用簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株,以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)研究用。

誘變育種的特點(diǎn)誘變育種具有方法簡單、快速和收效顯著等特點(diǎn)，仍是目前被廣泛使用的主要育種手段。

當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)中使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的菌株。誘變育種除能提高產(chǎn)量外,還可達(dá)到改善產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等目的。誘變育種的一般步驟1）出發(fā)菌株的選擇2）單細(xì)胞（或單孢子）懸液制備3）誘變劑和使用劑量的選擇4）變異株的初篩5）變異株的復(fù)篩6）變異株穩(wěn)定性試驗(yàn)7）菌種特性考察8）中試驗(yàn)證9）大型投產(chǎn)試驗(yàn)誘變育種的一般原則出發(fā)菌株一般應(yīng)具備特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力、對(duì)誘變劑的敏感性大、變異幅度大等條件。來源于野生型菌株或生產(chǎn)選育的高產(chǎn)菌株。1.出發(fā)菌株的選擇2.誘變因素的選擇誘變處理主要采用物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。目前常用的誘變劑主要有紫外線(UV),γ射線、硫酸二乙醋，N一甲基一N‘一硝基一N一亞硝基孤(NTG或MNNG)和亞硝基甲基脈(NMU)等。后兩種因有突出的誘變效果，被譽(yù)為“超誘變劑”。誘變的方法有單一誘變劑處理(野生菌株)和復(fù)合誘變劑處理(已誘變過的菌株)。誘變育種的一般原則各種誘變劑有不同的劑量表示方法。誘變劑的劑量與致死率有關(guān)，而致死率又與誘變率有一定關(guān)系，可用致死率作為各種誘變劑的相對(duì)劑量，用以選擇各種誘變劑的劑量。3.誘變劑劑量的選擇通常情況下，高劑量誘變劑處理后獲得的負(fù)突變率較高，而在偏低的劑量處理中獲得的正突變率較高，目前誘變劑處理劑量一般選擇死亡率為70%-80%時(shí)的劑量。在多核細(xì)胞中，仍然采用高劑量，因?yàn)樵诟邉┝空T變時(shí)，除個(gè)別核發(fā)生突變外，其他核均被致死，可形成較純的變異菌落，同也造成遺傳物質(zhì)的巨大損傷，可減少回復(fù)突變。誘變育種的一般原則誘變育種要求所處理的細(xì)胞必須是處于對(duì)數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。4.單袍了(或單細(xì)胞)懸液的制備細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)誘變處理會(huì)產(chǎn)生很大的影響，細(xì)菌一般在對(duì)數(shù)生長期的誘變處理效果較好，而霉菌和放線菌的分生孢子在稍加萌發(fā)時(shí)進(jìn)行誘變處理可提高誘變效率。分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，避免長出不純的菌落。得單細(xì)胞懸液的方法必須具有針對(duì)性，對(duì)產(chǎn)抱子或芽抱的微生物最好用其孢子或芽孢。在實(shí)際工作中，要得到均勻分散的細(xì)胞懸液，通?？捎脽o菌的玻璃珠來打散成團(tuán)的細(xì)胞.然后再用脫脂棉花或?yàn)V紙過濾。常用的物理誘變劑處理方法1.紫外線誘變紫外線誘變波長200-300nm，最有效的波長是260nm。采用15W的紫外燈管誘變效應(yīng)好。紫外線誘變的步驟與方法1.制備菌懸液2.紫外線照射3.后培養(yǎng)與稀釋涂布紫外線誘變?cè)硎笵NA雙鏈中的兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶核苷酸形成嘧啶二聚體，阻礙雙鏈的解開和復(fù)制，從而引起基因突變，最終導(dǎo)致表型的變化。。紫外線誘變環(huán)境紫外線進(jìn)行誘變處理時(shí)以及處理后的操作都應(yīng)在紅光下進(jìn)行，并且應(yīng)將微生物在黑暗的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。常用的物理誘變劑處理方法010203后培養(yǎng)與稀釋涂布照射完畢的菌懸液加人到適合的培養(yǎng)基中，在適宜溫度下暗培養(yǎng)1.5-2.Oh,培養(yǎng)結(jié)束后.從中吸取一定量培養(yǎng)物按一定稀釋度進(jìn)行稀釋，然后吸取稀釋液涂皿，以未經(jīng)紫外線照射過的菌懸液涂皿作為對(duì)照口。培養(yǎng)后，挑取菌落，以待篩選。紫外線照射處理前先開紫外燈預(yù)熱20min，使光波穩(wěn)定。然后，取30ml菌懸液置于7cm培養(yǎng)皿中，并置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌器上，離燈管一定距離，打開皿蓋，暴露子紫外線下照射一定時(shí)間，邊照射邊攪拌，力求使細(xì)胞均勻吸收紫外線光波。經(jīng)過紫外線誘變后的菌體轉(zhuǎn)入無菌試管內(nèi)，置于冰水中浸1-2h，抑制修復(fù)酶類的活性，使修復(fù)難以進(jìn)行，有利于提高突變率。制備菌懸液以處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌斜面、孢子剛成熟的霉菌或放線菌為出發(fā)菌，進(jìn)行適當(dāng)?shù)那芭囵B(yǎng)，離心除去液體培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液，加人玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙或脫脂棉花過濾，使形成單細(xì)胞，分散程度達(dá)90%以上。要求菌懸液濃度:細(xì)菌約為108個(gè)/mi}，放線菌為107-108個(gè)/mL,霉菌為106-107個(gè)/ml。紫外線誘變的步驟與方法:常用的物理誘變劑處理方法γ射線誘變?cè)恙蒙渚€誘變方法γ射線誘變劑量0103022.γ射線誘變?chǔ)蒙渚€是眾多光子組成的光子流，光子流是不帶電的，但與原子碰撞時(shí)，會(huì)把全部或部分能量傳遞給原子而產(chǎn)生次級(jí)電子，這些次級(jí)電子具有很高的能量，能產(chǎn)生電離作用，使堿基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵和糖一磷酸相連接的化學(xué)鍵斷裂，或者是由子電離輻射使水、有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，在這些自由基作用下容易引起DNA分了缺失、損傷或染色體畸變等?？梢灾苯訉?duì)平板上生長的菌落進(jìn)行照射，或者用直徑6-10mm的打孔器把菌落連瓊脂一同取出，置于滅菌平板內(nèi)進(jìn)行照射;也可以制成菌懸液，取1-2ml置于試管內(nèi)并浸人冰水中，再進(jìn)行照射。處理完畢后，把盛有菌體細(xì)胞的試管繼續(xù)冰浴2-3h，低溫可以降低或抑制修復(fù)酶的修復(fù)作用。γ射線的劑量單位以倫琴(R)來表示，即1cm2干燥空氣在0℃、一個(gè)大氣壓下產(chǎn)生2.08*109離子時(shí)所需的能量。γ射線穿透能力很強(qiáng)，無需反復(fù)多次照射。常用的物理誘變劑處理方法3.太空育種太空育種是太空條件處理微生物等誘變育種的有效方法，即衛(wèi)星搭載微生物等種子材料進(jìn)人太空，利用微重力等太空環(huán)境引發(fā)誘變，從而產(chǎn)生DAN不同程度的突變與光復(fù)活，返回地面后從中可選育出高產(chǎn)種子。常用的化學(xué)誘變劑處理方法

亞硝基孤為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出NO,顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)會(huì)降低。因此，亞硝基肌須保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低溫條件下貯存。亞硝基肌不溶于水，須加助溶劑，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。亞硝基胍能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。另外，亞硝基抓還能使多基因并發(fā)突變，在復(fù)制叉附近一個(gè)基因突變能誘發(fā)鄰近位置的基因陸續(xù)連鎖突變。亞硝基胍在水溶液中隨著不同的pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，從而影響誘變效應(yīng)。亞硝基胍（NTG）誘變

工業(yè)硝酸是一種常用的誘變劑，毒性小，不穩(wěn)定，易揮發(fā)，其鈉鹽容易在酸性緩沖液中分解產(chǎn)生NO和NO2,而NO2遇空氣又變成氮?dú)怏w，故配制時(shí)須加塞密封，并且要現(xiàn)配現(xiàn)用。亞硝酸可以直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的DNA分子，脫去堿基中的氨基變成