在體單向腸灌流法研究瑞香素腸吸收機制

在體單向腸灌流法研究瑞香素腸吸收機制

對藥物設(shè)計中殘留的殘余作用具有重要意義。目前預(yù)測藥物小腸吸收狀況的方法主要分為離體法和在體法。在體法中的大鼠單向腸灌流法能很好地模擬人體的體內(nèi)環(huán)境,且結(jié)果與人體試驗結(jié)果相關(guān)性良好,得以廣泛應(yīng)用。祖師麻為瑞香科植物黃瑞香(DaphnegiraldiNitsche)、陜甘瑞香(DaphnetanguticaMaxim或DaphneretusaHemsl)的干燥莖皮和根皮,具有祛風(fēng)濕,活血止痛的功效。臨床上主要用于風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛。前期實驗發(fā)現(xiàn)祖師麻中的瑞香素(也稱祖師麻甲素)含量較高,且與抗炎鎮(zhèn)痛和免疫作用密切相關(guān),為祖師麻治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要活性成分。上世紀(jì)80年代初,國內(nèi)有學(xué)者對瑞香素的代謝及藥代動力學(xué)進行了研究。結(jié)果表明,瑞香素半衰期較短,主要經(jīng)腎排泄,且排泄較快,在體內(nèi)能快速分布并消除。但由于當(dāng)時條件有限,研究尚不夠深入,限制了祖師麻藥材及制劑的進一步開發(fā)和利用。本文采用大鼠在體單向腸灌流模型考察瑞香素的吸收特性,以揭示瑞香素的腸道吸收機制,從而為瑞香素及祖師麻的劑型選擇和新劑型開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。ph、小鼠腸道吸收瑞香素的檢測儀器TU-1800S紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);Agilent1100型高效液相色譜儀,HP1100型二極管陣列檢測器,AgilentChemStation色譜工作站(Agilent科技有限公司);BT00-300M恒流蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。藥品及試劑瑞香素原料藥(金壇市思達化工有限公司,純度98%);瑞香素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:0900-200102);酚紅(上海試劑三廠);水合氯醛(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司);甲醇、冰醋酸(色譜純),其他試劑均為分析純。動物SD大鼠,雌雄各半,體重300~350g(南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心)。溶液的配制瑞香素對照品儲備液的配制:取瑞香素對照品適量,精密稱定,置于10mL量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容,搖勻得質(zhì)量濃度為0.814mg·mL-1的溶液,4℃放置,備用。瑞香素原料藥儲備液的配制:取瑞香素原料藥20mg,精密稱定,用DMSO0.5mL溶解,得到40mg·mL-1的原料藥儲備液,搖勻,4℃放置,備用。含酚紅的Krebs-Ringer試液(K-R試液,pH6.0):稱取CaCl20.37g,葡萄糖1.4g,分別加少量蒸餾水使溶解,再稱取酚紅20mg、NaCl7.8g、KCl0.35g、NaHCO31.37g、NaH2PO40.32g、MgCl20.02g,加蒸餾水溶解后與溶解的CaCl2及葡萄糖混勻,蒸餾水定容至1L,再用1mol·L-1HCl調(diào)pH值為6.0,備用。瑞香素腸灌流液的配制:精密吸取瑞香素原料藥DMSO儲備液適量,用含酚紅的K-R試液稀釋定容至200mL,配制質(zhì)量濃度為10、20和40μg·mL-1的供試液?？瞻啄c灌流液:K-R灌流液適量,按下述“大鼠在體單向腸灌流實驗”方法灌流,收集流出液,即得。大鼠在體單向腸灌流實驗取禁食(不禁水)16h的大鼠,稱重,10%水合氯醛麻醉(3.4mL·kg-1),沿腹中線打開腹腔,小心分離出待考察腸段,即十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸,取約10cm于兩端切口插管,結(jié)扎,用預(yù)熱至37℃的生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈,再用空氣將生理鹽水排凈。實驗時取不同濃度的供試液(預(yù)熱至37℃)200mL,先以1.0mL·min-1的流速灌流10min,再將流速調(diào)為0.2mL·min-1,預(yù)平衡30min后,于30~60、60~90、90~120、120~150min時間段收集灌流液樣品。取樣品0.5mL測定酚紅濃度,其余樣品立即酸化后,經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液進樣,測定峰面積,計算各個時間段灌流液樣品中瑞香素的含量。采用上述實驗方法分別考察瑞香素濃度、pH、腸段及P-gp等各因素對瑞香素腸道吸收的影響。最后剪取各個被灌流的腸段,測量腸內(nèi)徑以及長度。灌流液中酚紅濃度的測定取含瑞香素對照品和酚紅的K-R試液、不含酚紅的瑞香素的K-R試液以及含酚紅的K-R試液各0.5mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1mL、K-R試液3.5mL,搖勻,于400~700nm進行可見光掃描,確定測定波長及方法的專屬性。采用K-R緩沖液配制含酚紅10、20、30、40、50mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)液,分別吸取0.5mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1mL、K-R試液3.5mL,搖勻,測定吸收度,以酚紅質(zhì)量濃度(C,mg·L-1)對吸收度(A)進行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取酚紅質(zhì)量濃度為10、30和50mg·L-1樣品進行回收試驗,考察酚紅回收率。于一定時間點移取灌流液樣品續(xù)濾液0.5mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1mL、K-R試液3.5mL,搖勻,測定吸收度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計算酚紅濃度。灌流液中瑞香素濃度的測定HPLC色譜條件為HederaODS-2色譜柱(4.6mm×150mm,5μm);流動相為甲醇-0.5%冰醋酸(20∶80,v/v),流速1mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長327nm。在上述色譜條件下,將空白、含藥灌流液分別進樣,考察其方法的專屬性。精密吸取瑞香素對照品儲備液,以適量的K-R緩沖液將其分別稀釋為40.70、24.42、20.35、10.18、5.09μg·mL-1,分別以0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,進樣20μL,以質(zhì)量濃度(C,μg·mL-1)對峰面積(A)進行線性回歸,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用空白腸灌流液配制低、中、高(10.18、24.42、40.70μg·mL-1)3個濃度的瑞香素溶液,分別進樣,測定峰面積,考察瑞香素的回收率。于一定時間點移取灌流液適量,0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液按照上述色譜條件進樣分析。將測得的瑞香素的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計算相應(yīng)濃度。瑞香素在不同pH值的K-R液中穩(wěn)定性考察采用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)K-R緩沖液得到pH值分別為6.05、7.43、8.08,加入20μg·mL-1瑞香素,37℃水浴條件下放置,分別于0和3h取樣,測定瑞香素的含量。以峰面積計算降解殘存百分率。瑞香素在空白大鼠腸灌流液中穩(wěn)定性考察取空白大鼠腸灌流液(pH6.0)配制藥液,置于密閉容器中,于37℃的水浴中放置,分別于0和2h取樣,測定瑞香素的含量,以峰面積計算其降解殘存百分率。數(shù)據(jù)分析本文采用酚紅法對灌流液的流入和流出的體積進行校正,消除其體積變化的影響。在體大鼠單向腸灌流實驗中所測得的出口處的瑞香素的濃度用公式(1)校正:瑞香素的有效滲透系數(shù)Peff用公式(2),吸收速率參數(shù)Ka用公式(3)計算:式中Cout(corrected)和Cout分別為出口處經(jīng)校正后的瑞香素的濃度和實際測得的瑞香素的濃度;Cin灌流液中瑞香素的濃度;PRin、PRout分別為入口處和出口處酚紅的濃度;Q為腸道灌流液的流速(0.2mL·min-1);L和r分別為被灌流腸段的長度和內(nèi)徑(cm)。利用統(tǒng)計分析軟件SPSS11.5處理數(shù)據(jù),當(dāng)P<0.05時判定具有顯著性差異。結(jié)果以表示。結(jié)果1酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線酚紅的測定波長為558nm,腸灌流液中瑞香素對酚紅的測定沒有干擾。求出酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.1247C-0.009,r=0.9996(n=5)。酚紅在10~50mg·L-1線性關(guān)系良好。平均回收率為102.13%,RSD為1.22%。2素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程空白腸灌流液對瑞香素的測定沒有干擾,在測定波長327nm處,瑞香素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=158.33C-286.68,r=0.9993(n=5)。瑞香素在5.09~40.70μg·mL-1線性關(guān)系良好?；厥章蕿?8.21%~99.00%,RSD為0.61%~1.03%。3.1瑞香素在不同ph值的k-r溶液中的穩(wěn)定性研究3.2瑞香素在白色大鼠腸流液中的穩(wěn)定性研究4不同濃度瑞香素在體內(nèi)吸收nd10、20、40μg·mL-1的瑞香素在不同腸段的吸收參數(shù)見表4。本研究為多樣本均數(shù)的兩兩比較,各處理組間采用LSD檢驗(即Q檢驗)分析各個腸段及不同濃度之間的差異性。結(jié)果表明,瑞香素的質(zhì)量濃度在10~40μg·mL-1內(nèi),隨著濃度的增加,其吸收有上升的趨勢,在高濃度無飽和現(xiàn)象,低濃度與高濃度比較,空腸及結(jié)腸的Peff有顯著性差異(P<0.05),表明瑞香素在小腸內(nèi)吸收無自身濃度抑制作用,瑞香素可能以被動擴散的機制吸收進入體循環(huán)。另外,同一濃度下進行十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸灌流時發(fā)現(xiàn),在十二指腸、空腸、回腸的Peff、Ka之間無顯著性差異(P>0.05),瑞香素在小腸吸收較好,且在小腸無特殊的吸收窗。5p-gp外排作用對瑞香素吸收的影響取pH6.0的20μg·mL-1的瑞香素溶液200mL(含鹽酸維拉帕米100μmol·L-1)為灌流液,考察瑞香素的吸收是否受到P-gp外排作用的影響(表5)。結(jié)果表明,鹽酸維拉帕米對瑞香素在各腸段的有效滲透系數(shù)(Peff)以及吸收速率參數(shù)(Ka)未見顯著性影響(P>0.05),說明瑞香素可能不是P-gp的底物。體腸灌流實驗藥物在體腸吸收研究中,應(yīng)注意體系的密封性以及整個管路容器對藥物的吸附與解吸附,要求對輸送灌流液的管路質(zhì)地有較好的選擇。通過預(yù)實驗可知,灌流30min,從管路出來的灌流液能達到一個穩(wěn)態(tài)。因此,實驗設(shè)計灌流30min后流出液進行采集,充分保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性。小腸吸收的過程中,不僅吸收藥物也吸收水分,使供試液的體積減小,故不能用直接計算藥物濃度的方法計算剩余藥量。本實驗采用在腸道生理pH條件下不被腸道吸收的酚紅來標(biāo)定灌流液的體積,進而更為準(zhǔn)確地計算剩余藥量。此外,在體單向腸灌流實驗采用了較低的灌流速度(0.1~0.2mL·min-1)和較短的灌流時間,減小了灌流對腸壁的損傷,避免了酚紅被吸收,使酚紅可以很好地起到標(biāo)示體積的作用。瑞香素為香豆素類化合物,在堿性條件下易開環(huán),在酸性條件下以非解離狀態(tài)存在,穩(wěn)定性較好。本實驗室前期采用在體腸循環(huán)實驗研究瑞香素的吸收特征時,發(fā)現(xiàn)瑞香素在腸道內(nèi)的吸收隨著腸道pH值升高而增加,可能是由于腸道pH值升高堿性增強使得瑞香素發(fā)生了降解,從而將瑞香素降解的部分誤以為被腸道吸收。因此本實驗將瑞香素溶解在pH6.0的K-R試液中進行在體腸灌流,保證了瑞香素在灌流液中的穩(wěn)定性。取樣后的樣品需進行酸化以保證樣品測定的穩(wěn)定性,避免降解帶來的誤差,較好地反映瑞香素在大鼠體內(nèi)的吸收特性。雖然無法排除灌流時單次通過時間內(nèi)(30min)發(fā)生的降解量,但是由于十二指腸到回腸的pH值大致在5~7.5,灌流過程中pH值的變化不會很大;而結(jié)腸的pH在7~8之間,可能有些影響。本實驗研究發(fā)現(xiàn)酸化后,與結(jié)腸相比,瑞香素在小腸吸收較好,且不存在特異性的吸收部位,瑞香素的吸收機制可能為被動擴散。當(dāng)某化合物在大鼠平均Peff小于0.03×10-4cm·s-1或大于0.2×10-4cm·s-1時,可以預(yù)測該化合物在人體內(nèi)分別為吸收差或吸收完全。由本實驗可知,瑞香素屬于高滲透性藥物。此外,加入P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米后,瑞香素的吸收沒有增加。說明瑞香素可能不是P-gp的底物。上述研究結(jié)果提示,瑞香素或祖師麻口服劑型的設(shè)計時可以考慮采用適宜的輔料避免瑞香素在腸道內(nèi)的降解或制成pH依賴型制劑,使其較大程度在胃腸道上端釋放并被吸收。3段空白大鼠腸灌流液中的穩(wěn)定性20μg·mL-1瑞香素在pH分別為6.05、7.43、8.08的K-R液中穩(wěn)定性見表1。由表可見,瑞香素在pH6.0即弱酸性條件下的K-R液中較穩(wěn)定。瑞香素在