基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學技術(shù)瓶頸

基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學技術(shù)瓶頸

代謝組學是經(jīng)過基因組學、轉(zhuǎn)換組學和蛋白質(zhì)組學之后發(fā)展起來的系統(tǒng)生物學的一個新分支。它是通過研究水體的外部刺激、病理生理變化以及自身突變引起的體內(nèi)新陳代謝水平的動態(tài)反應來研究水體的科學。近年來,代謝組學已經(jīng)廣泛深入到生命科學的各個領(lǐng)域,并日益引起重視。代謝組學的主要分析手段有色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(包括GC-MS、LC-MS以及CE-MS)以及核磁共振(NMR)等。HPLC(尤其是超高效液相色譜(UPLC))與大氣壓電離質(zhì)譜(API-MS)相結(jié)合,具有良好的靈敏度、高動態(tài)范圍和通用性,已成為代謝組學研究中的主流分析手段。再結(jié)合多元統(tǒng)計分析可較容易地實現(xiàn)潛在生物標志物的發(fā)現(xiàn)。API-MS的重現(xiàn)性較差,不同類型儀器間的多級質(zhì)譜圖變異較大,無法像GC-MS以及NMR那樣在通用的數(shù)據(jù)庫里進行譜圖檢索定性,因此在單獨使用API-MS時難以確定代謝物的結(jié)構(gòu)。而在代謝指紋中大部分MS信號對應的代謝物仍然不明確,結(jié)構(gòu)鑒定成為基于液相色譜-質(zhì)譜的代謝組學研究的主要瓶頸之一,也是研究的熱點。MSI(MetabolomicsStandardsInitiative)發(fā)布了一系列關(guān)于代謝組學研究報告的規(guī)范,在文獻中規(guī)定了代謝組學研究中代謝物定性的4個層次(見表1)。生物體內(nèi)代謝物的數(shù)量尚無定論,數(shù)據(jù)從1000到200000不等。之所以有如此大的差異,一方面是物種差異;另一方面,是否包括脂質(zhì)、理論代謝物以及外源性代謝物是差異的主要來源。目前可購買到的標準物質(zhì)僅有5000種左右,包括1100種內(nèi)源性的核心代謝物、1200種美國食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批準的藥物、1300種美國FDA批準的食品添加劑、1500種植物化學物質(zhì)或植物次生代謝產(chǎn)物,代謝組學研究能真正準確定性的化合物也局限于此。因此未知物結(jié)構(gòu)鑒定仍是制約代謝組學技術(shù)發(fā)展的瓶頸,我們在長期工作的基礎(chǔ)上,針對樣本中難以區(qū)分的同分異構(gòu)體標志物的鑒定和識別,構(gòu)建了基于微型制備、保留指數(shù)、質(zhì)譜、核磁共振等的集成技術(shù)流程。而常規(guī)代謝組學研究的代謝物鑒定中,一般直接利用獲取的質(zhì)譜信息鑒定化合物,常見的獲取候選分子結(jié)構(gòu)的方式有兩種:一種是直接采用獲得的分子離子峰和二級質(zhì)譜信息進行譜圖庫檢索;另一種是首先進行化合物元素組成判定,再基于獲取的元素組成進行數(shù)據(jù)庫檢索。然后通過標準物質(zhì)驗證,最終獲得準確的定性結(jié)果,具體流程如圖1所示。1級質(zhì)譜的獲取準確檢測離子峰的質(zhì)荷比是質(zhì)譜檢測的目標,也是質(zhì)譜定性的關(guān)鍵。分辨率的提高為質(zhì)量精度的提高提供了基礎(chǔ)。從統(tǒng)計學的角度,儀器的分辨率和質(zhì)量準確度密切相關(guān):質(zhì)量誤差(em)與檢測化合物質(zhì)荷比的質(zhì)譜的分辨率(R)成反比,同時也與離子信號強度(S,假設只有信號噪聲)密切相關(guān)。目前主要的質(zhì)譜類型及其分辨率和質(zhì)量準確度見表2。最新的15T的傅里葉變換離子回旋質(zhì)譜(FT-ICR-MS)提供了目前最高的分辨率(10000000)和質(zhì)量精度(<0.1×10-6(ppm)),但過慢的掃描速度導致難以與液相色譜尤其是超高效液相色譜聯(lián)用,限制了其在組學研究中的應用。目前使用最普遍的是飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)和軌道離子阱質(zhì)譜(OrbitrapMS)。盡管OrbitrapMS可提供接近FT-ICR-MS的分辨率和質(zhì)量精度,但其同位素峰豐度比的準確性較TOF和FT-ICR-MS差。數(shù)據(jù)依賴采集方式(data-dependent-acquisitionmode,DDA)是代謝組學中獲取二級質(zhì)譜的主要方式之一。但這種方式也有缺點,由于檢測的是一級掃描中最強的幾個峰,可能選擇的是來源于源內(nèi)裂解碎片或其他加和離子(如[M+Na]+),而不是關(guān)注的準分子離子[M+H]+。Matsuda等進行了多次重疊小窗口(每次檢測60Da)的DDA實驗以研究擬南芥的代謝物表達,獲取了接近1600個質(zhì)譜信號,基于獲取的二級質(zhì)譜定性了167種代謝物。另一種新的二級質(zhì)譜獲取方式稱為MSE,在碎裂前母離子不進行篩選,采用離子的Pearson相關(guān)系數(shù)或泊松分布建模進行母離子和子離子關(guān)聯(lián),這種方法可以全面獲取所有離子的二級質(zhì)譜信息。2質(zhì)譜條件的確定通常認為高質(zhì)量準確度是確定化合物元素組成最重要的前提,精確質(zhì)量數(shù)測定及分子式識別軟件Massworks改變了只有高分辨率質(zhì)譜才能測定精確質(zhì)量的觀念,應用譜圖準確性的概念極大地提升了化合物分子式預測的準確性,即使單位質(zhì)量分辨的四極桿儀器也可以使質(zhì)量測定的準確度達到5×10-6(ppm)。要確定復雜體系中化合物分子式,高分辨的質(zhì)譜仍然是不可或缺的。隨著目標物質(zhì)量數(shù)的增加,其可能的分子式也快速增多,即使質(zhì)量準確度達到1×10-6(ppm),仍然無法獲得理想的結(jié)果。例如,質(zhì)量數(shù)為900,質(zhì)量準確度為1×10-6(ppm)時可能的分子式達到345個。因此需要嚴格地限制條件以去除錯誤的結(jié)果。Kind和Fiehn確立了7條黃金法則用于分子式有效性的判斷,除了其中的第7條只適用于GC-MS外,其他包括元素數(shù)量限制、LEWISSENIOR規(guī)則、同位素峰模式、其他元素與碳的比值等同樣適用于LC-MS。不同元素的穩(wěn)定同位素含量存在差異,相對分子質(zhì)量相似的不同元素組成的物質(zhì),其M+1和M+2峰的相對豐度存在差異,因此同位素峰模式匹配對確定化合物的元素組成非常重要。Kind和Fiehn的研究結(jié)果表明,采用同位素峰模式匹配可以去除超過95%的錯誤分子式,采用3×10-6(ppm)的質(zhì)量準確度結(jié)合2%的同位素豐度模式誤差的檢索結(jié)果優(yōu)于單純采用1×10-6(ppm)質(zhì)量準確度的結(jié)果。在上述算法基礎(chǔ)上,Pluskal等進一步利用MS/MS信息獲得了更加準確的分子式確定結(jié)果。解決代謝物分子式確定的另一理想途徑是采用同位素標記。在植物和微生物中常采用全13C標記,通過離子對的匹配獲取準確的分子式。Giavalisco等應用上述技術(shù)在擬南芥中鑒定了超過1000種代謝物(分子式)。對于超高分辨率的質(zhì)譜而言,確定分子式相對較為簡單。因為不同元素的重同位素與其最高豐度的單同位素的相對分子質(zhì)量差存在細微的差異:13C和12C的相對分子質(zhì)量差為1.00335Da;17O和16O的相對分子質(zhì)量差為1.00422Da;15N和14N的相對分子質(zhì)量差為0.99703Da;2H和1H的相對分子質(zhì)量差為1.00682Da;33S和32S的相對分子質(zhì)量差為0.99939Da。圖2為不同分辨率下?；悄懰岬腗+1峰:當質(zhì)譜分辨率達到800000時,M+1中N、S、C、H的單重同位素峰獲得良好的分離;分辨率達到2000000時,C和O的單重同位素峰也獲得了分離?；谏鲜龇蛛x結(jié)果可較為簡便地獲取物質(zhì)的分子式。3質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫hmdb元素組成為化合物的分子結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)。但問題是隨著相對分子質(zhì)量的增加,可能的同分異構(gòu)體數(shù)量迅速增加。更為簡便合理的方式是檢索已知的化學結(jié)構(gòu)和天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫,去除大量不合理或不存在的同分異構(gòu)體。以分子式C15H12O7為例,采用分子結(jié)構(gòu)生成軟件MOLGEN-MS進行預測,可能的分子結(jié)構(gòu)達到78800個,但在KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配的化合物僅為3個。當然,這樣做也存在風險,對于全新的化合物可能會得出錯誤的結(jié)果。近幾年數(shù)據(jù)庫發(fā)展飛速,代謝組學研究中常用的數(shù)據(jù)庫(見表3)包括4種類型:(1)一般化學數(shù)據(jù)庫(如PubChem),涵蓋合成和/或天然的化合物;(2)代謝通路數(shù)據(jù)庫(如BioCyc);(3)代謝物數(shù)據(jù)庫(如人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HumanMetabolomeDatabase,HMDB));(4)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(如NIST)。實際上,目前的許多數(shù)據(jù)庫同時涵蓋上述多個功能。HMDB是目前應用較為廣泛的數(shù)據(jù)庫,綜合了大量的文獻數(shù)據(jù),包括在人體中發(fā)現(xiàn)的小分子代謝物的詳細信息。HMDB數(shù)據(jù)庫(Version3.5)收集了超過4萬個內(nèi)源性代謝物,以及與之相關(guān)的超過5000個蛋白質(zhì)(DNA)信息。該數(shù)據(jù)庫不僅可以提供臨床化學數(shù)據(jù)以及外源數(shù)據(jù)庫(如KEGG、Metlin、Biocyc等)的鏈接,而且還支持質(zhì)譜圖和核磁共振譜圖的檢索功能。譜圖檢索是質(zhì)譜定性的常用方法,尤其在GC-MS數(shù)據(jù)上的應用較多。但對于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的譜圖檢索仍然存在較大的問題,因為所采用的儀器種類不同以及二級質(zhì)譜采集參數(shù)的差異,均能導致二級質(zhì)譜碎片種類及強度的巨大差異。目前HMDB、METLIN、NIST、MassBank等數(shù)據(jù)庫提供電噴霧離子化(ESI)譜圖檢索功能,但在應用時需要注意:不同儀器類型甚至不同碰撞能都可能導致檢索結(jié)果的差異;不同數(shù)據(jù)庫的匹配得分計算方式也存在較大差異;檢索過程是否考慮母離子的質(zhì)荷比也存在不同,MassBank是檢索所有譜圖,METLIN有一個選項可確定母離子,而HMDB必須人為輸入母離子質(zhì)量窗口。僅依靠二級質(zhì)譜所能獲取的結(jié)構(gòu)信息是有限的。如體液中磺基化、葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物和植物代謝物中的生物堿、皂苷類化合物等,通過二級質(zhì)譜往往只能確定其類別,無法準確確定其分子結(jié)構(gòu),導致在組學研究中仍存在大量的代謝物無法獲得準確鑒定。離子阱尤其是離子阱與高分辨質(zhì)譜串聯(lián)(如線性離子阱-軌道阱組合質(zhì)譜聯(lián)用儀(LTQ-Orbitrap))產(chǎn)生的多級質(zhì)譜(MSn)提供了豐富的結(jié)構(gòu)信息,在實際應用中可以鑒定更多的化合物。實際應用過程中有些同分異構(gòu)體無法采用二級質(zhì)譜進行準確區(qū)分,往往需要多級質(zhì)譜進行穩(wěn)健的區(qū)別?；诙嗉壻|(zhì)譜的譜圖樹(spectraltrees)技術(shù)使基于質(zhì)譜的代謝物的鑒定更加準確和穩(wěn)健。LC-MS受掃描速度的限制,一般只能采集MS3,如果想獲得多級的譜圖樹信息,就需要收集餾分,在nano-ESI下采用直接進樣模式。RojasCherto等構(gòu)建了549個代謝物的872個多級質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫,建立了譜圖樹相似度計算方法,可進行譜圖樹檢索,同時還比較了在線和離線狀態(tài)下獲取的譜圖,表明不同采集模式下的譜圖具有良好的重現(xiàn)性。4譜圖的預測和分析譜圖檢索是處理代謝組學產(chǎn)生的大量質(zhì)譜信息的重要手段,但數(shù)據(jù)庫很難全面覆蓋研究目標,而解析未知物質(zhì)譜必須有質(zhì)譜專家的參與。隨著計算機技術(shù)的飛速發(fā)展,計算機輔助譜圖解析技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。化合物結(jié)構(gòu)的碎裂有一定的規(guī)律,質(zhì)譜專家就是基于這些規(guī)律對譜圖進行解析的。質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析軟件MassFrontier通過歸納和總結(jié)文獻以及自有譜圖庫的數(shù)據(jù)構(gòu)建了化合物碎裂的規(guī)則庫,基于規(guī)則庫可以對已知結(jié)構(gòu)的化合物可能產(chǎn)生的碎片離子及其生成途徑進行預測?；谒榱岩?guī)律的譜圖預測的商品化軟件還有ACD/MSFragmenter、MOL-GEN-MS等。斷裂規(guī)律一般由質(zhì)譜專家總結(jié)獲得,但理論計算化學(如密度泛函理論,Densityfunctionaltheory,DFT)也可以對結(jié)構(gòu)中可能的斷裂位點進行預測。但軟件所采納的斷裂規(guī)律不可能全面,另外對單一化合物而言并非所有規(guī)律都適用。Horai等采用ACD/MSFragmenter和MassFrontier對MassBank數(shù)據(jù)庫中的453個代謝物進行了譜圖預測,獲得了12000個可能的離子碎片,只有3%的離子在實際譜圖中得到了確證。目前代謝物的譜圖庫仍非常有限,許多已知化合物沒有參比譜圖,Hill等最先將譜圖預測技術(shù)用于此類“已知的未知化合物”的鑒定。Wolf等構(gòu)建的MetFrag也基于相同的途徑:首先通過準確質(zhì)量數(shù)在上游數(shù)據(jù)庫(包括KEGG、Pubchem、ChemSpider等)中進行檢索,獲取候選化合物列表;然后根據(jù)斷裂規(guī)律對候選化合物進行譜圖預測,并通過預測譜圖和實際譜圖的對比對候選化合物進行評分和篩選。2008年,B9cker等提出采用碎片樹(FragmentationTree,FT)來注釋二級質(zhì)譜圖,圖上的節(jié)點標示碎片的分子式,連接線標示中性丟失。碎片樹的構(gòu)建不需要分子結(jié)構(gòu)的信息,碎片樹是根據(jù)離子的分子式與常見的(中性、自由基)丟失列表,和質(zhì)譜碎裂的規(guī)律相結(jié)合,自動判斷二級質(zhì)譜圖中的離子之間的關(guān)聯(lián)性,計算各個離子可能的生成途徑。對比結(jié)果表明,基于二級質(zhì)譜圖的碎片樹與多級質(zhì)譜以及MassFrontier的結(jié)果對應很好。盡管碎片樹結(jié)構(gòu)非常類似于譜圖樹,但兩者存在明顯區(qū)別。碎片樹是通過譜圖庫中已有的二級質(zhì)譜計算得到的,而譜圖樹是通過多級質(zhì)譜實驗獲得的,當然碎片樹同樣可以根據(jù)多級質(zhì)譜的信息獲取。相