5種杜鵑幼苗的生理生化特性及耐熱機(jī)制分析

5種杜鵑幼苗的生理生化特性及耐熱機(jī)制分析

中國(guó)是世界上恢復(fù)和分布的杜鵑花植物的中心。雖然有豐富的野生花卉資源，但這些野生資源主要分布在中國(guó)西南部的海拔地區(qū)。受遺傳因素的制約,該屬植物喜冷涼、濕潤(rùn)環(huán)境,耐熱性較差,高溫?zé)岷κ侵萍s其遷地保育及園林應(yīng)用的主要限制因子。杜鵑花種類繁多、遺傳資源豐富,不同種間的生態(tài)習(xí)性和耐熱性存在較大差異。為了探討杜鵑花屬植物的耐熱機(jī)制及不同種間的適應(yīng)性差異,近年來(lái)部分學(xué)者針對(duì)杜鵑花屬植物開(kāi)展了高溫脅迫實(shí)驗(yàn),篩選出一批與杜鵑花耐熱性有關(guān)的形態(tài)及生理指標(biāo)。然而,植物耐熱性是受多基因控制的數(shù)量性狀,且受環(huán)境條件的復(fù)雜性和植物對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性等多因子影響,故僅憑個(gè)別或少數(shù)指標(biāo)的簡(jiǎn)單比較難以真實(shí)地反映植物耐熱性的遺傳本質(zhì)。主成分分析法可以在不損失或很少損失原有信息的前提下,將原來(lái)數(shù)量較多且彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成新的個(gè)數(shù)較少且彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo),并在此基礎(chǔ)上計(jì)算出供試植物的每個(gè)綜合指標(biāo)值及其相應(yīng)的隸屬函數(shù)值,經(jīng)加權(quán)求和可得到供試植物的抗逆性綜合評(píng)價(jià)值。近年來(lái),該方法已被應(yīng)用于大白菜(BrassicapekinensisRupr.)、小麥(TriticumsestivumL.)和水稻(OryzasativaL.)等農(nóng)作物和一些綠化植物的抗逆性評(píng)價(jià),并取得了較為客觀可靠的評(píng)價(jià)效果,但尚未見(jiàn)有關(guān)杜鵑花屬植物耐熱性鑒定與評(píng)價(jià)方面的研究報(bào)道。為探索和建立快速、有效的杜鵑花耐熱性的鑒定方法,作者對(duì)高溫脅迫條件下5種杜鵑花屬植物實(shí)生苗的6個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定和相關(guān)性分析,并應(yīng)用主成分分析和隸屬函數(shù)法對(duì)5種杜鵑的耐熱性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià),據(jù)此建立了最優(yōu)回歸方程,以期為杜鵑花屬植物耐熱性的鑒定、評(píng)價(jià)、預(yù)測(cè)及耐熱種質(zhì)的發(fā)掘和遺傳改良提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1種子和苗木來(lái)源供試種類有映山紅亞屬[Subgen.Tsutsusi(G.Don)Pojark.]的白花杜鵑[Rhododendronmucronatum(Blume)G.Don]、馬銀花亞屬(Subgen.AzaleastrumPlanch.exK.Koch)的毛棉杜鵑(R.moulmainenseHook.f.)、羊躑躅亞屬[Subgen.Pentanthera(G.Don)Pojark.]的羊躑躅[R.molle(Blume)G.Don]、常綠杜鵑亞屬[Subgen.Hymenanthes(Blume)K.Koch]的紅灘杜鵑(R.chihsinianumChunetFang)和杜鵑亞屬(Subgen.RhododendronL.)的紅棕杜鵑(R.rubiginosumFranch.),均為江西省·中國(guó)科學(xué)院廬山植物園內(nèi)同批播種的4年生實(shí)生苗。2009年4月初,選取大小一致且生長(zhǎng)健壯的5種杜鵑的4年生實(shí)生苗栽植于高9cm、上口徑11.5cm、底徑8.5cm的塑料盆中,每盆1株,栽培基質(zhì)為當(dāng)?shù)亓窒碌谋韺痈惩?土壤中有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.87%和6.63%,速效氮、速效磷和速效鉀的質(zhì)量濃度分別為266.20、22.17和83.65mg·kg-1,pH4.79。供試苗置于常溫溫室中培養(yǎng),采用日常養(yǎng)護(hù)管理方法,3個(gè)月后進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)。1.2方法1.2.1自然氣候條件分別設(shè)置22℃(對(duì)照)、30℃(輕度高溫脅迫)和38℃(重度高溫脅迫)3組處理;每組處理設(shè)3次重復(fù),每一重復(fù)6株苗。實(shí)驗(yàn)在空氣相對(duì)濕度80%、光照時(shí)間12h·d-1、光照強(qiáng)度120μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中進(jìn)行。盆底設(shè)置托盤(水深1.0～1.5cm)補(bǔ)充基質(zhì)水分。脅迫處理6d后,隨機(jī)采集當(dāng)年生功能葉(成熟葉),去除中脈;一部分直接用于丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)和脯氨酸(Pro)含量的測(cè)定;另一部分置于-70℃保存,用于超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的測(cè)定。1.2.2抗氧化酶mda、sod、cat、apx活性測(cè)定MDA含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)的方法并略加改進(jìn)。稱取0.5g新鮮葉片,加入體積分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸與體積分?jǐn)?shù)0.5%硫代巴比妥酸的等體積混合液5mL及少許石英砂,研磨至勻漿;沸水浴中保溫30min后,置于冰浴中迅速冷卻;用3-18K離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司生產(chǎn))于10000g離心10min;取上清液,采用UV-3100PC掃描式紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司生產(chǎn))測(cè)定450、532和600nm處的吸光值,根據(jù)下列公式計(jì)算樣品中的MDA含量:MDA含量=6.45×(A532-A600)-0.56×A450。采用文獻(xiàn)的方法測(cè)定H2O2含量。于波長(zhǎng)390nm處測(cè)定吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=70.185x-0.663(x為吸光值,y為H2O2含量)計(jì)算樣品中H2O2含量。Pro含量測(cè)定參照文獻(xiàn)的酸性茚三酮法并略加改進(jìn)。取新鮮葉片0.5g,加入少許石英砂及5mL體積分?jǐn)?shù)3%磺基水楊酸,研磨至勻漿;沸水浴中保溫10min后,冰浴冷卻,765g離心10min;取上清液1mL,加入1mL冰乙酸、1mL蒸餾水和2mL酸性茚三酮,混勻后置于沸水浴中保溫60min,冰浴冷卻后加入4mL甲苯,振蕩30s,靜置;取上層液于波長(zhǎng)520nm處測(cè)定吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=34.793x+0.140(x為吸光值,y為Pro含量)計(jì)算樣品中Pro含量。采用NBT光還原法測(cè)定SOD活性,以抑制50%氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原為1個(gè)酶活力單位;采用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性,以1min內(nèi)A240變化0.1為1個(gè)酶活力單位;采用文獻(xiàn)的方法測(cè)定APX活性,以1min內(nèi)A290變化0.01為1個(gè)酶活力單位。各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果取平均值。1.3不同溫度下不同復(fù)配不同結(jié)構(gòu)不同土主成分分析參照曾憲海等及張?jiān)频鹊姆椒?。首先?duì)各指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化;計(jì)算各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)矩陣以及主成分貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率,并按累計(jì)貢獻(xiàn)率大于或等于85%確定主成分個(gè)數(shù);根據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣與初始因子載荷矩陣之間的關(guān)系求出特征向量矩陣(系數(shù)矩陣);建立主成分方程表達(dá)式并計(jì)算綜合指標(biāo)值。依據(jù)文獻(xiàn)中的公式計(jì)算5種杜鵑在不同溫度條件下各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值U(xj)、各綜合指標(biāo)的權(quán)重Wj和各種類的耐熱綜合評(píng)價(jià)值D。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的數(shù)據(jù)處理、相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)計(jì)算和逐步回歸分析等均運(yùn)用Excel2007和SPSS17.0軟件完成。2結(jié)果和分析2.1在高溫條件下，對(duì)五種杜鵑生理生化指標(biāo)的變化進(jìn)行了分析2.1.1高溫脅迫對(duì)不同植物葉片px活性的影響高溫脅迫條件下,5種杜鵑丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)和脯氨酸(Pro)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1數(shù)據(jù)可見(jiàn):與對(duì)照(22℃)相比,30℃和38℃高溫脅迫條件下5種杜鵑葉片的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均發(fā)生了變化,其中MDA、H2O2和Pro含量以及CAT和APX活性均隨處理溫度的升高而增加;在30℃脅迫條件下,SOD活性略高于對(duì)照,而在38℃脅迫條件下則低于對(duì)照。由表1還可見(jiàn):高溫脅迫條件下5種杜鵑葉片各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化幅度均存在較大差異,因而無(wú)法采用某一單項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)供試5種杜鵑的耐熱性強(qiáng)弱,也說(shuō)明植物的耐熱性是一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀。2.1.2活性指標(biāo)間的相關(guān)性高溫脅迫條件下,5種杜鵑6個(gè)生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出:6個(gè)生理生化指標(biāo)間均存在著一定的相關(guān)性,其中有些指標(biāo)間的相關(guān)性達(dá)到了顯著或極顯著的水平。SOD活性與APX活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與H2O2和Pro含量及CAT活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;其他指標(biāo)間均呈正相關(guān)關(guān)系。其中,CAT活性與H2O2和Pro含量及APX活性間均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),APX活性與Pro含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),從而使得它們所提供的信息發(fā)生了重疊。因此,直接利用這些指標(biāo)難以準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)5種杜鵑種間的耐熱性強(qiáng)弱,需要應(yīng)用主成分分析方法。2.1.3主成分特征提取高溫脅迫條件下供試5種杜鵑6個(gè)生理生化指標(biāo)的主成分分析結(jié)果見(jiàn)表3。表3數(shù)據(jù)顯示:前3個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為52.01%、19.20%和16.31%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)87.52%。表明前3個(gè)綜合指標(biāo)反映了原指標(biāo)的絕大部分信息,可以代替原來(lái)6個(gè)生理生化指標(biāo)對(duì)5種杜鵑的耐熱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。將前3個(gè)綜合指標(biāo)分別定義為第1、第2和第3主成分,根據(jù)杜鵑6個(gè)測(cè)定指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值和綜合指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化特征向量(表3),可得到第1、第2和第3主成分的回歸方程,分別為:CI(1)=0.1862X1+0.4098X2+0.4647X3-0.2287X4+0.5270X5+0.5010X6;CI(2)=0.6550X1+0.2441X2-0.0494X3+0.7072X4+0.0158X5-0.0913X6;CI(3)=-0.6239X1+0.2680X2+0.3529X3+0.4560X4+0.2558X5-0.3762X6。主成分特征向量為各主成分表達(dá)式中的原始變量標(biāo)準(zhǔn)化值的系數(shù)向量,它們代表了各變量對(duì)相應(yīng)的主成分作用權(quán)數(shù),即各單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)大小。由主成分方程式及表3結(jié)果可知:第1主成分特征向量較大的是CAT和APX活性,其次是Pro和H2O2含量;第2主成分特征向量最大的是SOD活性,其次是MDA含量;第3主成分中絕對(duì)值最大的特征向量是MDA含量(為負(fù)值),其次是SOD活性。高溫脅迫條件下CAT和APX活性及Pro含量的增加均有利于活性氧的清除和維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定,因此第1主成分主要反映了高溫脅迫條件下植物體內(nèi)清除H2O2的能力,可定義為H2O2清除因子。SOD是清除O??22-?的關(guān)鍵酶,對(duì)減輕活性氧引發(fā)的膜脂過(guò)氧化傷害具有保護(hù)作用,而MDA是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物,也是衡量膜系統(tǒng)受害程度的重要指標(biāo),故第2和第3主成分可定義為維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因子。通過(guò)降維,可把原來(lái)6個(gè)相互關(guān)聯(lián)的生理生化指標(biāo)轉(zhuǎn)換成3個(gè)新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo),并保留了原指標(biāo)的絕大部分信息。對(duì)于同一綜合指標(biāo)而言,數(shù)值越大,說(shuō)明某一種類在這一綜合指標(biāo)上的耐熱性越強(qiáng),反之則越弱。但是,杜鵑不同種類的耐熱性并不是由某一個(gè)綜合指標(biāo)決定的,而是由3個(gè)綜合指標(biāo)共同決定的,而這3個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率不同、所起的作用也不相同,因此應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的綜合評(píng)價(jià)。2.2在高溫條件下，對(duì)五種杜鵑的冷卻和干燥進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和測(cè)試2.2.1不同種類林分不同熱值的杜仲?gòu)?fù)合材料根據(jù)主成分表達(dá)式及隸屬函數(shù)公式分別求得5種杜鵑在不同溫度條件下的各綜合指標(biāo)值CI(x)及其隸屬函數(shù)值U(x),詳見(jiàn)表4。對(duì)于同一個(gè)綜合指標(biāo)而言,如CI(1),白花杜鵑在38℃脅迫條件下,其CI(1)值(3.2817)最大,對(duì)應(yīng)的U(1)值(1.0000)也最大,表明38℃時(shí)白花杜鵑的綜合指標(biāo)CI(1)表現(xiàn)出最強(qiáng)的耐熱性。根據(jù)貢獻(xiàn)率大小及累計(jì)貢獻(xiàn)率(表3)計(jì)算出各綜合指標(biāo)的權(quán)重,分別為0.5943、0.2194、0.1863(表4)。根據(jù)各綜合指標(biāo)的U(x)值和權(quán)重,得出5種杜鵑在不同溫度條件下的耐熱性綜合評(píng)價(jià)值D(表4)。D值反映了不同種類的綜合耐熱能力大小,D值越大,表明其耐熱能力越強(qiáng)。由表4可見(jiàn):在38℃條件下,5種杜鵑的D值均最大;30℃條件下D值次之;而在22℃條件下D值最小。在同一溫度條件下,5種杜鵑的綜合耐熱能力排序有一定差異:22℃條件下,5種杜鵑的D值由大到小依次為白花杜鵑、毛棉杜鵑、紅灘杜鵑、羊躑躅、紅棕杜鵑;30℃條件下依次為白花杜鵑、毛棉杜鵑、羊躑躅、紅灘杜鵑、紅棕杜鵑;38℃條件下則依次為白花杜鵑、羊躑躅、毛棉杜鵑、紅灘杜鵑、紅棕杜鵑。在3個(gè)溫度條件下白花杜鵑的D值均最大,表明其耐熱性最強(qiáng);紅棕杜鵑的D值均最小,表明其耐熱性最弱。毛棉杜鵑D值較大、紅灘杜鵑較小;在22℃條件下羊躑躅D值相對(duì)較小,但隨著脅迫溫度的升高其D值排序逐漸上升,說(shuō)明杜鵑花對(duì)高溫脅迫的耐性受到脅迫強(qiáng)度的影響,不同種類、不同脅迫強(qiáng)度下其耐熱機(jī)制存在一定差異。2.2.2不同溫度下抗高溫能力的回歸分析將不同溫度條件下5種杜鵑的耐熱性綜合評(píng)價(jià)值(D)作因變量、各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值作自變量,采用逐步回歸法建立的最優(yōu)回歸方程為:D=0.4718+0.0313X1+0.0752X2+0.0663X3+0.0453X4+0.0724X5+0.0295X6。式中,X1、X2、X3、X4、X5和X6分別代表MDA、H2O2和Pro含量及SOD、CAT和APX活性的標(biāo)準(zhǔn)化值。6個(gè)自變量的偏回歸系數(shù)均達(dá)到了極顯著水平,回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9999,表明6個(gè)自變量可決定D值總變異的99.99%。用該回歸方程對(duì)不同溫度條件下5種杜鵑的耐熱性進(jìn)行預(yù)測(cè),其預(yù)測(cè)值(表4)與綜合評(píng)價(jià)值D在各種類及溫度間的大小次序完全一致,兩者高度相關(guān)(r=1)并達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明該方程能夠很好地量化各種類的綜合耐熱能力與各指標(biāo)值間的因果關(guān)系,可用于對(duì)杜鵑種間耐熱性進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。3在不同溫度下對(duì)管理系統(tǒng)所進(jìn)行的綜合評(píng)價(jià)植物耐熱性不僅與其種類、發(fā)育時(shí)期、形態(tài)性狀及代謝活動(dòng)有關(guān),且受逆境的發(fā)生時(shí)期、持續(xù)時(shí)間、脅迫強(qiáng)度和強(qiáng)弱變化以及研究的目的性狀等多種因素的影響,是植物與環(huán)境相互作用的結(jié)果。不同植物耐熱機(jī)制不同、對(duì)某一具體指標(biāo)的耐熱反應(yīng)也不盡相同,單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確、真實(shí)地反映植物的耐熱性強(qiáng)弱,多種指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)則較為科學(xué)準(zhǔn)確。但多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)又存在以下問(wèn)題:各指標(biāo)間具有一定的相關(guān)性而使信息發(fā)生交叉與重疊,各指標(biāo)在綜合評(píng)價(jià)中的重要性(權(quán)重)也不同,因此不能直接利用多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本研究利用各指標(biāo)間內(nèi)在的深層次聯(lián)系,采用主成分分析法將原來(lái)個(gè)數(shù)較多且彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成個(gè)數(shù)較少且相互獨(dú)立的綜合指標(biāo),克服了信息的重疊和指標(biāo)間的相關(guān)性;并在此基礎(chǔ)上計(jì)算出每個(gè)物種的綜合指標(biāo)值及相應(yīng)的隸屬函數(shù)值和權(quán)重,避免了人為確定權(quán)重的主觀性;通過(guò)加權(quán)求和法,得到了每一物種在不同溫度條件下的耐熱性綜合評(píng)價(jià)值,這樣既考慮了各指標(biāo)間的相互關(guān)系,又考慮了各指標(biāo)的重要性,從而使獲得的評(píng)價(jià)結(jié)果更為科學(xué)合理。主成分分析結(jié)果表明:6個(gè)原始指標(biāo)可被轉(zhuǎn)換成3個(gè)綜合指標(biāo),累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)87.52%。在貢獻(xiàn)率最大的第1主成分中,CAT和APX活性的特征向量較大,其次是Pr