第六章 原核細(xì)胞基因工程

第六章原核細(xì)胞基因工程第六章原核細(xì)胞基因工程在基因工程中，目的基因的異源表達(dá)主要包括三個(gè)要素目的蛋白的DNA編碼序列、表達(dá)載體、表達(dá)宿主(受體細(xì)胞或受體菌)。目的基因表達(dá)要素目的基因載體宿主需要表達(dá)的DNA序列運(yùn)送外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞表達(dá)目的基因的細(xì)胞（原核或真核）在基因工程中，目的基因的異源表達(dá)主要包括三個(gè)要素目的蛋白的DNA編碼序列、表達(dá)載體、表達(dá)宿主(受體細(xì)胞或受體菌)。其中，利用原核細(xì)胞作為表達(dá)宿主進(jìn)行目的基因重組表達(dá)被稱為原核表達(dá)，相應(yīng)的基因工程技術(shù)被稱為原核細(xì)胞基因工程。①原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)生物，具有生長(zhǎng)快、代謝易于控制的特點(diǎn)，可通過發(fā)酵迅速獲得大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。②原核生物只有一種RNA聚合酶(真核細(xì)胞有三種)，識(shí)別原核基因的啟動(dòng)子，催化所有RNA的合成。③因?yàn)樵松餆o核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，二者也是連續(xù)進(jìn)行的；而且在翻譯過程中，mRNA可與多個(gè)核糖體結(jié)合形成多核糖體(polyribosome)，即在一條mRNA鏈上可以有多個(gè)核糖體同時(shí)進(jìn)行合成反應(yīng)，大大提高了翻譯效率。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)。本章內(nèi)容第一節(jié)原核表達(dá)系統(tǒng)的種類第二節(jié)原核表達(dá)策略第三節(jié)基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)第四節(jié)原核表達(dá)產(chǎn)物的分離純化第五節(jié)基因工程菌不穩(wěn)定性及對(duì)策第六節(jié)原核表達(dá)應(yīng)用舉例第一節(jié)

原核表達(dá)系統(tǒng)的種類一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)主要包括表達(dá)載體和受體菌株。其中，表達(dá)載體是將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并在宿主中實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)的運(yùn)輸工具。原核細(xì)胞表達(dá)載體的主體部分主要來自于相應(yīng)宿主菌株的內(nèi)源質(zhì)粒，以此為基礎(chǔ)添加與克隆表達(dá)相關(guān)的元件，即構(gòu)成完整表達(dá)載體。原核表達(dá)載體除具有克隆載體所具有的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性選擇標(biāo)記等以外，還帶有原核細(xì)胞所需要的表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止子和SD序列，有時(shí)還包括融合標(biāo)簽的DNA編碼序列等。優(yōu)點(diǎn)：它的遺傳背景清晰，基因工程操作手段完善；代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚；已有大量可供選用的大腸桿菌表達(dá)載體；它的培養(yǎng)成本低廉，生長(zhǎng)繁殖迅速，

抗污染能力強(qiáng)，適合于大規(guī)模培養(yǎng)；外源基因產(chǎn)物的表達(dá)量高，目的蛋白可以占細(xì)菌總蛋白的30%以上，因此是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺點(diǎn)：目的蛋白常形成包涵體，導(dǎo)致后期純化過程繁瑣，應(yīng)用成本高；由于原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，所以在表達(dá)某些真核基因時(shí)，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物無法正確折疊或進(jìn)行糖基化、磷酸化修飾，致使產(chǎn)物的生物活性相對(duì)較低。大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定；大腸桿菌細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，痕量的內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用的外源基因表達(dá)的載體有：pET系統(tǒng)、pBV等。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。1.BL21(DE3)該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。2.BL21(DE3)pLysS該菌株含有質(zhì)粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾目的蛋白的表達(dá)。該菌適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。4.JM109

該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性。芽孢桿菌為革蘭陽性細(xì)菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白質(zhì)到體外，為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種，能形成芽孢，而子囊中只有一個(gè)芽孢。除個(gè)別種如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)外，其他芽孢桿菌對(duì)人畜無毒。二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①芽孢桿菌是非致病微生物，比較安全；②培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于控制；③生長(zhǎng)迅速，周期短；④表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中；⑤多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性；⑥某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，且利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺點(diǎn)：野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

因此，在構(gòu)建芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)宿主菌時(shí)需要將蛋白酶基因進(jìn)行突變或敲除，使其降低活性甚至失活。遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備。二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用：適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌。目前應(yīng)用較多的芽孢桿菌宿主菌有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢杄菌、淀粉芽孢杄菌、巨大芽孢桿菌、球形芽孢杄菌、短芽孢杄菌、嗜熱脂肪芽孢杄菌、耐堿的芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等。

其中，枯草芽孢桿菌(又稱枯草桿菌，Bacillussubtilis)表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的，枯草芽孢桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，人們對(duì)其遺傳背景和生理學(xué)特性的了解僅次于大腸桿菌。鏈霉菌是一類革蘭陽性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中，能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①鏈霉菌為非致病菌，使用比較安全；②不產(chǎn)生內(nèi)毒素；③表達(dá)產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外；④可進(jìn)行高密度培養(yǎng)；⑤具有豐富的次生代謝途徑和初級(jí)、次生代謝調(diào)控系統(tǒng)；⑥鏈霉菌進(jìn)行工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵的技術(shù)成熟。缺點(diǎn)：遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用：鏈霉菌受體系統(tǒng)中常用的宿主菌有變鉛青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌。天藍(lán)色鏈霉菌有很強(qiáng)的修飾系統(tǒng)，因此在實(shí)際應(yīng)用中均以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)。變鉛青鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌的卡那霉素抗性基因(Kan)、牛生長(zhǎng)激素基因、人白細(xì)胞介素2基因、人乙肝表面抗原(HBsAg)基因、人類干擾素(IFN-a2、IFN-a1)基因、人類腫瘤壞死因子(TNF)基因等。三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)1952年，美國微生物學(xué)家賽爾曼·A·瓦克斯曼（SelmanA.Waksman）因“發(fā)現(xiàn)鏈霉素——第一個(gè)有效對(duì)抗結(jié)核病的抗生素”獲得了當(dāng)年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。藍(lán)藻又稱藍(lán)細(xì)菌，是一類能夠進(jìn)行植物型放氧光合作用的原核生物，有大約150個(gè)屬，2000余種。藍(lán)藻具有獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，多年來一直被廣泛應(yīng)用于光合作用、固氮作用和葉綠體起源等生物學(xué)問題的研究中。近年來，隨著藍(lán)藻分子生物學(xué)研究的深入，藍(lán)藻也開始被作為表達(dá)外源目的基因的受體系統(tǒng)。四.藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①藍(lán)藻遺傳背景簡(jiǎn)單，便于基因操作和外源DNA的檢測(cè)；②藍(lán)藻是革蘭陰性菌，細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化；③光合自養(yǎng)型生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、CO2、無機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長(zhǎng)需要，生產(chǎn)成本低；④多數(shù)藍(lán)藻有內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了良好的條件；⑤藍(lán)藻在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期均處于感受態(tài)，便于外源基因的轉(zhuǎn)化；四.藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：⑥多數(shù)藍(lán)藻無毒，且富含蛋白質(zhì)，早已用作食品或保健品，在此基礎(chǔ)上開展轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，將一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍(lán)藻，可達(dá)到錦上添花的效果。四.藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用第二節(jié)

原核細(xì)胞表達(dá)策略①目的基因DNA片段的制備。目的基因可以從基因組中進(jìn)行擴(kuò)增，也可以通過人工合成的方法獲得。值得注意的是，原核細(xì)胞中缺乏真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，因此目的基因不能用真核生物的基因組DNA，而應(yīng)該用cDNA。②目的基因與表達(dá)載體的連接。表達(dá)載體中，在啟動(dòng)子區(qū)的下游設(shè)計(jì)有多克隆位點(diǎn)，目的基因的DNA片段通過這些位點(diǎn)插入到啟動(dòng)子的下游，受到相應(yīng)啟動(dòng)子的調(diào)控。③將重組載體導(dǎo)入到宿主菌中，從而獲得相應(yīng)的基因工程菌株。一般的轉(zhuǎn)化方法包括化學(xué)法、電轉(zhuǎn)化等。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)主要包括以下步驟外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)主要包括以下步驟④對(duì)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在生長(zhǎng)量達(dá)到一定水平后誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，根據(jù)啟動(dòng)子的類型，分為組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)。⑤檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量及活性，然后進(jìn)行分離純化。一.融合型表達(dá)將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因的閱讀框，這樣形成的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。外源蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)時(shí)能以較高的效率進(jìn)行，因?yàn)槭荏w菌自身蛋白基因的SD序列和堿基組成等有利于基因的表達(dá)。常見的融合蛋白表達(dá)載體包括pRSET、pGEX系列等。一.融合型表達(dá)表達(dá)融合型蛋白時(shí)，為了得到正確的真核蛋白，在插入真核基因時(shí)，應(yīng)非常注意其閱讀框架，確保融合的各個(gè)DNA片段的閱讀框架一致，只有這樣，在翻譯時(shí)才不至于產(chǎn)生移碼突變。以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高，尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離，利用受體蛋白建立相應(yīng)抗體、配體、底物親和層析系統(tǒng)，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達(dá)率高，與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件。目的蛋白溶解性好，由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收，融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。一.融合型表達(dá)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因要能高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化。外源基因應(yīng)在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件。兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架。一.融合型表達(dá)用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫親和層析pRIT2T硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構(gòu)象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促進(jìn)分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）維持良好空間構(gòu)象一.融合型表達(dá)目的蛋白的回收：一.融合型表達(dá)融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法和酶促裂解法?；瘜W(xué)斷裂法：一.融合型表達(dá)用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr），它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近?；瘜W(xué)斷裂法：一.融合型表達(dá)如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。一.融合型表達(dá)蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。

酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CArgCNNC受體蛋白目的蛋白酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)一.融合型表達(dá)

蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的。酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)一.融合型表達(dá)為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。

純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。目的蛋白的回收ATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCXa-1ATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaIXa因子切割位點(diǎn)IleGluGlyArgGlu酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列生物素結(jié)合肽編碼序列SP6T7AproritacMCSPinpointXa啟動(dòng)子受體基因GST接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）谷胱甘肽酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)二.非融合型表達(dá)不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱為非融合蛋白。非融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它具有非常近似于真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。二.非融合型表達(dá)非融合蛋白的最大缺點(diǎn)是容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。為了在原核細(xì)胞中表達(dá)出非融合蛋白，可將帶有起始密碼ATG的真核基因插到原核啟動(dòng)子與SD序列的下游，組成一個(gè)雜合的核糖體結(jié)合區(qū)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯，得到非融合蛋白。不易分離純化。三.分泌型表達(dá)大腸桿菌中某些蛋白質(zhì)屬于分泌型蛋白質(zhì)，可以被分泌到細(xì)胞膜外的間質(zhì)中，這是由于在這些蛋白質(zhì)的N端存在著一段稱為信號(hào)肽(signalpeptide)的多肽。在信號(hào)肽的幫助下，蛋白質(zhì)可以跨過細(xì)胞膜而分泌到胞外。蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感。三.分泌型表達(dá)大腸桿菌中某些蛋白質(zhì)屬于分泌型蛋白質(zhì)，可以被分泌到細(xì)胞膜外的間質(zhì)中，這是由于在這些蛋白質(zhì)的N端存在著一段稱為信號(hào)肽(signalpeptide)的多肽。在信號(hào)肽的幫助下，蛋白質(zhì)可以跨過細(xì)胞膜而分泌到胞外。因此，將編碼信號(hào)肽的DNA序列插入到載體的啟動(dòng)子與目的基因之間，就可使目的基因編碼的蛋白質(zhì)分泌到胞外，減少了細(xì)菌蛋白酶的破壞，同時(shí)為表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等提供了極大的方便。三.分泌型表達(dá)常用的分泌型表達(dá)載體包括pINⅢ、plN-ompA等系列。三.分泌型表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化了發(fā)酵后處理的純化工藝；減少了外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶降解的概率；通過對(duì)分泌表達(dá)的設(shè)計(jì)有利于形成正確的空間構(gòu)象，獲得有較好生物學(xué)活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。三.分泌型表達(dá)缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。四.多拷貝表達(dá)外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平與目的基因的拷貝數(shù)相關(guān)。研究表明，當(dāng)表達(dá)載體上外源基因的拷貝數(shù)增加時(shí)，可將外源蛋白的表達(dá)量相應(yīng)提高。表達(dá)載體上可表達(dá)的基因包括外源基因和選擇標(biāo)記基因等，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒表達(dá)載體的拷貝數(shù)增加時(shí)，用于合成目的蛋白之外的其他蛋白質(zhì)的量也相應(yīng)增加，而過多地表達(dá)非目的基因消耗大量能量，影響菌株的生長(zhǎng)代謝。因而在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，可以考慮將多個(gè)外源蛋白基因串聯(lián)在一起，克隆在嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒載體上。四.多拷貝表達(dá)以這種策略表達(dá)外源蛋白時(shí)，雖然宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)減少，但外源基因在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA的拷貝數(shù)并不減少。這種方法對(duì)分子量較小的外源蛋白更為有效。四.多拷貝表達(dá)外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：一是多表達(dá)單元的重組，即每個(gè)表達(dá)單元都含有獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串聯(lián)翻譯的表達(dá)單元，表達(dá)單元之間的連接方向與表達(dá)效率無關(guān)。表達(dá)的外源蛋白不須經(jīng)過裂解處理。這種方式適合于表達(dá)分子量較大的蛋白質(zhì)。典型的編碼蛋白質(zhì)的原核基因結(jié)構(gòu)示意圖四.多拷貝表達(dá)外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：一是多表達(dá)單元的重組，即每個(gè)表達(dá)單元都含有獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串聯(lián)翻譯的表達(dá)單元，表達(dá)單元之間的連接方向與表達(dá)效率無關(guān)。表達(dá)的外源蛋白不須經(jīng)過裂解處理。這種方式適合于表達(dá)分子量較大的蛋白質(zhì)。二是多順反子重組，即多拷貝外源基因有各自的SD序列、翻譯起始和終止信號(hào)，但這些基因的轉(zhuǎn)錄使用共同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子，表達(dá)的外源蛋白分子仍是相互獨(dú)立的，這種方式對(duì)表達(dá)中等大小分子量的外源蛋白比較合適。四.多拷貝表達(dá)外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：三是多編碼序列重組，即將多個(gè)外源基因串聯(lián)在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和翻譯起始與終止密碼子，在各自編碼序列的連接處引入蛋白酶酶切位點(diǎn)或可被化學(xué)斷裂的位點(diǎn)，這種方式適合表達(dá)外源小分子量蛋白質(zhì)或多肽。五.整合型表達(dá)將一種重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的代謝會(huì)發(fā)生較大改變，同時(shí)由于細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，經(jīng)若干次傳代后宿主細(xì)胞內(nèi)的重組質(zhì)粒會(huì)發(fā)生丟失。因此，一種理想的選擇是將要表達(dá)的外源基因整合到宿主菌的染色體的特定位置上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。五.整合型表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：目的基因表達(dá)穩(wěn)定整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義。缺點(diǎn)：目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償。在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：DNA體內(nèi)重組的基本原理（1）轉(zhuǎn)位因子依賴型（2）同源序列依賴型轉(zhuǎn)位因子是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子，例如：轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族DNA體內(nèi)重組的基本原理噬菌體

G片段（G-Fragment）真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty）原核細(xì)菌 插入順序（IS）高等植物

可移動(dòng)因子（Ac、Ds）高等動(dòng)物 跳躍基因（mobilgene）轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)IS（1kb）Ty（5kb）Tn（2-20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識(shí)別位點(diǎn)阻遏基因IRIRIRIRISISDNA體內(nèi)重組的基本原理在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細(xì)菌種類、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。一般地說，距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)。（2）同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式DNA體內(nèi)重組的基本原理（2）同源序列依賴型：同源交換DNA體內(nèi)重組的基本原理染色體DNA同源區(qū)域標(biāo)記基因ori目的基因整合位點(diǎn)（2）同源序列依賴型：同源交換DNA體內(nèi)重組的基本原理ori同源區(qū)域交換區(qū)域染色體DNA目的基因標(biāo)記基因ori+六.提高表達(dá)效率的方法1.啟動(dòng)子的選擇2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)3.選擇強(qiáng)終止子4.提高表達(dá)載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性1.啟動(dòng)子的選擇原核基因的表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平，以操縱子為單位，因此啟動(dòng)子的正確選擇是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白高表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。原核生物的啟動(dòng)子一般由四部分構(gòu)成：①轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；②Pribnowbox(也稱-10區(qū))；③Sextama框(也稱-35區(qū))；④間隔區(qū)。①作用要強(qiáng)，待表達(dá)的基因產(chǎn)物要占有或超過菌體總蛋白的10%~30%；②必須表現(xiàn)最低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，最好選用高密度培養(yǎng)細(xì)胞和表現(xiàn)最低基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的可誘導(dǎo)或非抑制啟動(dòng)子，以減少合成的外源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用或?qū)ζ渖L(zhǎng)的限制作用；③啟動(dòng)子具有簡(jiǎn)便和廉價(jià)的可誘導(dǎo)性。1.啟動(dòng)子的選擇能在原核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用的啟動(dòng)子很多，為了提高表達(dá)水平，這些啟動(dòng)子必須具有以下特性：目前，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中最常用的是來自于大腸桿菌噬菌體的T7啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子(乳糖啟動(dòng)子)、trp啟動(dòng)子(色氨酸啟動(dòng)子)、λ噬菌體PL啟動(dòng)子(λ噬菌體的左向啟動(dòng)子)以及tac啟動(dòng)子(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)等。1.啟動(dòng)子的選擇啟動(dòng)子具有如下特征：(1)序列特異性。在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守序列框，序列框中堿基的變化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的滯后和轉(zhuǎn)錄速度的減慢。(2)方向性。啟動(dòng)子是一種有方向性的順式調(diào)控元件，在正反兩種方向中只有一種具有啟動(dòng)功能。(3)位置特異性。啟動(dòng)子只能位于所啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄基因的上游或者基因內(nèi)的前端，處于基因的下游或在基因的上游但遠(yuǎn)離所要啟動(dòng)的基因，則一般不會(huì)有作用。1.啟動(dòng)子的選擇啟動(dòng)子具有如下特征：(4)種屬特異性原核生物的不同種、屬，真核生物的不同組織都具有不同類型的啟動(dòng)子。但一般來說，親緣關(guān)系越近的兩種生物，其啟動(dòng)子通用的可能性也越大。1.啟動(dòng)子的選擇啟動(dòng)子的構(gòu)建啟動(dòng)子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtraAPlacPtacTTGACATTGATATAGACATTTACATTGACATATAATTATAATTAATGTTATAATGATACTPtrpTTGACATTAACTEEAEE啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè)目的基因A酶切開目的基因啟動(dòng)子Bal31酶解野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高啟動(dòng)子的可控性（lac啟動(dòng)子）乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性：基底水平轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)高效轉(zhuǎn)錄POPO野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP結(jié)合啟動(dòng)子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性：cAMPCAP高效轉(zhuǎn)錄基底水平轉(zhuǎn)錄cAMP濃度降低葡萄糖代謝高效轉(zhuǎn)錄PlacPlacPlacUV5OOO啟動(dòng)子的可控性（lac啟動(dòng)子）色氨酸啟動(dòng)子Ptrp的可控性：色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受是大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動(dòng)子，在色氨酸操縱子的調(diào)控中，細(xì)胞中色氨酸的濃度是重要的調(diào)控因素，B-吲哚丙烯酸是色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，它能與阻遏蛋白結(jié)合，阻止色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，是一種轉(zhuǎn)錄促進(jìn)劑。如果刪除了衰減子則可使轉(zhuǎn)錄效率提高8~10倍。色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白除去色氨酸PtrpOtrp或加3-吲哚丙烯酸（IAA）高效轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄PtrpOtrpPtrpOtrp啟動(dòng)子的可控性（trp啟動(dòng)子）啟動(dòng)子的構(gòu)建啟動(dòng)子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtraAPlacPtacTTGACATTGATATAGACATTTACATTGACATATAATTATAATTAATGTTATAATGATACTPtrpTTGACATTAACTtac啟動(dòng)子亦稱為trp-lac啟動(dòng)子，是一組由lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子。tac啟動(dòng)子受乳糖操縱子的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，當(dāng)存在有高水平的lac阻遏蛋白時(shí)，tac啟動(dòng)子受到抑制，如加入IPTG后，可使tac啟動(dòng)子去阻遏并誘導(dǎo)其表達(dá)。啟動(dòng)子的可控性（tac啟動(dòng)子）PL和PR啟動(dòng)子分別是λ噬菌體基因組上的左向和右向啟動(dòng)子，它們都是強(qiáng)啟動(dòng)子，比lac啟動(dòng)子的活性高8~10倍。

PL和PR啟動(dòng)子受λ噬菌體cI基因產(chǎn)物的負(fù)調(diào)控。cI基因產(chǎn)物是溫度敏感蛋白，是PL和PR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的阻遏蛋白。在較低溫度(28~32℃)培養(yǎng)時(shí)，cI基因產(chǎn)物產(chǎn)生抑制作用，在溫度升至42℃時(shí)，其被破壞，于是PL和PR啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄。在構(gòu)建帶有PL和PR啟動(dòng)子表達(dá)載體時(shí)，需將cI基因組裝在表達(dá)載體上，或選擇溶源化入噬菌體的大腸桿菌作為該表達(dá)載體的宿主菌，如N99cI+菌株。啟動(dòng)子的可控性（PL和PR啟動(dòng)子）T7噬菌體啟動(dòng)子是目前最常用的啟動(dòng)子，如Invitrogen公司的pET系列就是采用的該啟動(dòng)子。在該系統(tǒng)中，目的基因的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7噬菌體RNA聚合酶，所以在構(gòu)建帶有T7噬菌體啟動(dòng)子表達(dá)載體時(shí)，需要配合使用能表達(dá)T7噬菌體RNA聚合酶的受體菌，這些菌株是被噬菌體溶源化的，如JM109(DE3)、BL21(DE3)、HMS174(DE3)等。啟動(dòng)子的可控性（T7噬菌體啟動(dòng)子）六.提高表達(dá)效率的方法1.啟動(dòng)子的選擇2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)3.選擇強(qiáng)終止子4.提高表達(dá)載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)mRNA在細(xì)菌中的翻譯效率嚴(yán)格依賴于是否有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在，這是因?yàn)榧?xì)菌在翻譯水平上的調(diào)控是不嚴(yán)格的，只有mRNA和核糖體的結(jié)合，才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-bindingsite，RBS)是指緊靠啟動(dòng)子下游的，從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸幾十個(gè)堿基長(zhǎng)度的一段序列，翻譯起始密碼子AUG通常位于它的中心位置，是核糖體RNA識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)。2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)在原核生物中，RBS又被稱為SD序列，是位于起始密碼子AUG上游3~10bp處、由3~9bp組成的一致性序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16sRNA3-末端的富含嘧啶核苷酸的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列(AAGGA或UAAGGAGG)與起始密碼子(AUG)的間距對(duì)翻譯起始效率影響較大。當(dāng)lac啟動(dòng)子的SD序列距ATG為7個(gè)核苷酸時(shí)，目的基因的表達(dá)最高，而間隔8個(gè)核苷酸時(shí)，表達(dá)水平下降500倍。mRNA與rRNA的互補(bǔ)區(qū)域越長(zhǎng)，基因翻譯的概率就越大。SD序列與起始密碼子之間的堿基組成也影響翻譯的起始效率。SD序列所在的翻譯起始區(qū)應(yīng)避免出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，否則將會(huì)降低翻譯起始效率。六.提高表達(dá)效率的方法1.啟動(dòng)子的選擇2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)3.選擇強(qiáng)終止子4.提高表達(dá)載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性3.選擇強(qiáng)終止子在基因的3′-末端或一個(gè)操縱子的3′-末端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子或簡(jiǎn)稱終止子。終止子是表達(dá)載體中必不可少的元件，既可避免高水平轉(zhuǎn)錄對(duì)高拷貝質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響，又可使轉(zhuǎn)錄出的mRNA盡可能短，以提高mRNA的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。依據(jù)轉(zhuǎn)錄終止機(jī)理的不同，原核生物的轉(zhuǎn)錄終止子可以分為兩類：依賴于

因子的終止子(弱終止子)和不依賴于

因子的終止子(強(qiáng)終止子)。3.選擇強(qiáng)終止子在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，一般使用強(qiáng)終止子終止外源基因的表達(dá)。六.提高表達(dá)效率的方法1.啟動(dòng)子的選擇2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)3.選擇強(qiáng)終止子4.提高表達(dá)載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性4.提高表達(dá)載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)和穩(wěn)定性強(qiáng)化外源基因在原核宿主菌中高效表達(dá)的中心環(huán)節(jié)是提高mRNA的數(shù)量。這可通過兩種途徑來實(shí)現(xiàn)：一是用強(qiáng)啟動(dòng)子以提高轉(zhuǎn)錄效率；二是將外源基因克隆在高拷貝的表達(dá)載體上。質(zhì)粒分子過量增殖消耗大量能量，影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定以及外源基因宏觀表達(dá)水平的降低。解決這一問題的一種有效策略是在表達(dá)載體中采用可調(diào)控的誘導(dǎo)型復(fù)制子來控制質(zhì)粒的增殖。例如，pCP3表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制子來源于溫度敏感型質(zhì)粒pKN402，可受溫度誘導(dǎo)。質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子。在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60；在42℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300–600，在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)pCP3MCSPLAproriVectorsCopyNumberoripUC~500-700pMB1(derivative)pBR322~15-20pMB1pET~15-20pBR322pGEX~15-20pBR322pColE1~15-20ColE1pR6K~15-20R6KpACYC~10p15ApSC101~5pSC101pBluescript~300-500ColE1(derivative)andF1pGEM~300-500pUCandF1常見質(zhì)粒載體拷貝數(shù)及其復(fù)制子表7-1原核表達(dá)載體上的常用復(fù)制子受體菌復(fù)制子大腸桿菌pMBIp15ApColE1pSC101芽孢桿菌pUB110pC194pE194pHY481pWT481鏈霉菌pIJ101SCP2pIJ702pIJ61pIJ699pKC796藍(lán)藻pPbspPKE2pUC104pSG111六.提高表達(dá)效率的方法1.啟動(dòng)子的選擇2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)3.選擇強(qiáng)終止子4.提高表達(dá)載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性(degeneracy)，除個(gè)別氨基酸(色氨酸和甲硫氨酸)外，大多數(shù)氨基酸都具有兩個(gè)或者兩個(gè)以上的密碼子。這種編碼相同氨基酸的一組密碼子稱為同義密碼子(synonymcodon)。5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性(degeneracy)，除個(gè)別氨基酸(色氨酸和甲硫氨酸)外，大多數(shù)氨基酸都具有兩個(gè)或者兩個(gè)以上的密碼子。這種編碼相同氨基酸的一組密碼子稱為同義密碼子(synonymcodon)。通過對(duì)大腸桿菌各種基因序列的大量分析表明，同義密碼子在基因中出現(xiàn)的頻率并不一樣，即密碼子使用存在差異的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象同樣存在于真核生物中，稱為密碼子偏好或密碼子偏愛(codonpreference)。5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性研究者對(duì)大腸桿菌中的密碼子使用頻率進(jìn)行系統(tǒng)分析得到以下結(jié)論：①大多數(shù)簡(jiǎn)并密碼子中的一個(gè)或兩個(gè)具有偏好；②某些密碼子對(duì)所有不同的基因都是常用的，如CCG是脯氨酸最常用的密碼子；③表達(dá)強(qiáng)度高的基因比表達(dá)強(qiáng)度低的基因表現(xiàn)更大程度的密碼子偏好性；④同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的tRNA含量呈高度相關(guān)。5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性不同生物甚至同種生物的不同蛋白質(zhì)的基因?qū)?jiǎn)并密碼子的使用有一定的選擇性。一般來說稀有密碼子含量較高(或稀有密碼子連續(xù)岀現(xiàn))的外源基因，在翻譯過程中容易發(fā)生提前終止或移碼突變或翻譯速率變慢?？刹扇∠铝写胧?/p>

①在受體菌中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因，以提高受體菌中稀有密碼子tRNA的豐度；

②在不改變外源基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)的前提下，可通過突變或者基因重新合成方法將外源基因中的稀有密碼子改為受體菌中的偏愛密碼子。密碼子優(yōu)化密碼子優(yōu)化技術(shù)，使得優(yōu)化后的proteinα表達(dá)水平相比未優(yōu)化的序列提高了10倍。5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性外源基因全合成。

按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法。本章內(nèi)容第一節(jié)原核表達(dá)系統(tǒng)的種類第二節(jié)原核表達(dá)策略第三節(jié)基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)第四節(jié)原核表達(dá)產(chǎn)物的分離純化第五節(jié)基因工程菌不穩(wěn)定性及對(duì)策第六節(jié)原核表達(dá)應(yīng)用舉例第四節(jié)

原核表達(dá)產(chǎn)物的分離純化傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品提取精制的差異差異項(xiàng)目傳統(tǒng)發(fā)酵基因工程發(fā)酵產(chǎn)品分子量一般為小分子，對(duì)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分析比較透徹大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)表達(dá)物細(xì)胞內(nèi)定位細(xì)胞內(nèi)外都有一般位于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量表達(dá)量低表達(dá)量高提取方法簡(jiǎn)單復(fù)雜一、分離純化的目標(biāo)與策略利用轉(zhuǎn)基因工程菌株表達(dá)外源基因所獲得的目標(biāo)蛋白的分離和純化，一般包括兩大步驟：一是初步分離獲得初提物，這一過程具體包括細(xì)胞破碎、蛋白類物質(zhì)的分離以及對(duì)特異表達(dá)蛋白的沉淀和超濾濃縮等；二是對(duì)初提物進(jìn)行進(jìn)一步提純，提高其品質(zhì)，這一過程所采用的手段包括色譜和電泳等。分離純化的目標(biāo)分離純化的目標(biāo)：將重組蛋白質(zhì)從雜質(zhì)蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類以及其他代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基成分中分離出來。分離產(chǎn)物所需達(dá)到的目標(biāo)與產(chǎn)物的用途有關(guān)。如果分離純化的蛋白質(zhì)只是用作一般實(shí)驗(yàn)室研究使用，則一般不會(huì)過多地考慮作為基因工程藥物所顧及的純度和安全性，而且事實(shí)上也不會(huì)有純度為100%的蛋白質(zhì)。如果作為蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析、序列測(cè)定或作為人體注射用藥物，則純度和安全性將是考慮的最重要的因素。對(duì)于生產(chǎn)者和客戶來說，生產(chǎn)成本也是考慮的重要因素之一。(1)確定分離純化策略時(shí)必須考慮的因素①表達(dá)系統(tǒng)的影響。基因工程表達(dá)系統(tǒng)的影響包括工程菌的種類或細(xì)胞類型、代謝特征、表達(dá)方式(胞內(nèi)、胞外、包含體)、表達(dá)產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、代謝物種類、產(chǎn)物類似物毒素和能降解表達(dá)產(chǎn)物的酶類等。第四章基因工程的載體第一節(jié)質(zhì)粒載體第二節(jié)噬菌體載體第三節(jié)酵母載體第四節(jié)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體第五節(jié)病毒表達(dá)載體第六節(jié)人工染色體載體(1)確定分離純化策略時(shí)必須考慮的因素①表達(dá)系統(tǒng)的影響。基因工程表達(dá)系統(tǒng)的影響包括工程菌的種類或細(xì)胞類型、代謝特征、表達(dá)方式(胞內(nèi)、胞外、包含體)、表達(dá)產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、代謝物種類、產(chǎn)物類似物毒素和能降解表達(dá)產(chǎn)物的酶類等。②表達(dá)產(chǎn)物性質(zhì)的影響。重組蛋白質(zhì)本身的物理、化學(xué)與生物學(xué)特性，包括化學(xué)組成分子量、等電點(diǎn)、電荷分布和密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴(kuò)散性、分配系數(shù)、吸附性能、生物學(xué)活性、親和性、配基種類和表面活性等都是分離純化的重要依據(jù)，必須充分考慮。同時(shí)應(yīng)該考慮到重組蛋白質(zhì)都是具有生物活性的大分子。(1)確定分離純化策略時(shí)必須考慮的因素③初始物料、雜質(zhì)等因素的影響。由于使用的菌種不同，所需的原始物料及由此產(chǎn)生的雜質(zhì)也有很大不同，這些因素都會(huì)對(duì)目的產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)生影響。④生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)條件的影響。生產(chǎn)工藝包括生產(chǎn)方式(連續(xù)、分批、半連續(xù))、生產(chǎn)周期、生產(chǎn)能力、工藝控制等，生產(chǎn)條件主要是指生產(chǎn)中的環(huán)境條件、衛(wèi)生條件、無菌狀態(tài)與滅菌方法等，這些因素也會(huì)影響產(chǎn)物的分離純化。(2)制定合理的純化方式和純化工藝蛋白質(zhì)純化包含許多方法，包括沉淀、色譜、電泳、離心等各種分離方法，但如何將這些方法有機(jī)地結(jié)合起來，形成完整的工藝過程則是最為重要的環(huán)節(jié)。沉淀。硫酸銨或乙醇等進(jìn)行沉淀可獲得2~8倍純化目標(biāo)蛋白。沉淀硫酸銨沉淀法是粗分離蛋白時(shí)常用的純化和濃縮蛋白的技術(shù)。蛋白質(zhì)的溶解度和鹽濃度密切相關(guān)，在低濃度的條件下，隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)的溶解度增加；但在高濃度的鹽溶液里，鹽離子競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合蛋白表面的水分子，破壞蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白質(zhì)在疏水作用下聚集形成沉淀。(2)制定合理的純化方式和純化工藝蛋白質(zhì)純化包含許多方法，包括沉淀、色譜、電泳、離心等各種分離方法，但如何將這些方法有機(jī)地結(jié)合起來，形成完整的工藝過程則是最為重要的環(huán)節(jié)。沉淀。硫酸銨或乙醇等進(jìn)行沉淀可獲得2~8倍純化目標(biāo)蛋白。超濾離心。超濾可分離相對(duì)分子質(zhì)量在1,000~300,000間的蛋白質(zhì)。(2)制定合理的純化方式和純化工藝蛋白質(zhì)純化包含許多方法，包括沉淀、色譜、電泳、離心等各種分離方法，但如何將這些方法有機(jī)地結(jié)合起來，形成完整的工藝過程則是最為重要的環(huán)節(jié)。沉淀。硫酸銨或乙醇等進(jìn)行沉淀可獲得2~8倍純化目標(biāo)蛋白。超濾離心。超濾可分離相對(duì)分子質(zhì)量在1,000~300,000間的蛋白質(zhì)。色譜。經(jīng)過沉淀、超濾處理的樣品常進(jìn)一步進(jìn)行柱色譜，以快速捕獲蛋白質(zhì)，盡可能減少蛋白質(zhì)降解和其他修飾。(2)制定合理的純化方式和純化工藝融合標(biāo)簽。對(duì)于重組蛋白，一般已在其C端或N端連接上了一個(gè)融合標(biāo)簽，包括與底物或抑制劑親和的全酶、與單克隆抗體結(jié)合的抗原表位、由IMAC復(fù)性的寡聚組氨酸、血凝素識(shí)別的碳水化合物結(jié)合蛋白或結(jié)合域、體內(nèi)生物素化的生物素結(jié)合域等。利用這個(gè)標(biāo)簽可以進(jìn)行親和色譜純化以獲得目標(biāo)蛋白。用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫親和層析pRIT2T硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構(gòu)象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促進(jìn)分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）維持良好空間構(gòu)象一.融合型表達(dá)(2)制定合理的純化方式和純化工藝融合標(biāo)簽。對(duì)于重組蛋白，一般已在其C端或N端連接上了一個(gè)融合標(biāo)簽，包括與底物或抑制劑親和的全酶、與單克隆抗體結(jié)合的抗原表位、由IMAC復(fù)性的寡聚組氨酸、血凝素識(shí)別的碳水化合物結(jié)合蛋白或結(jié)合域、體內(nèi)生物素化的生物素結(jié)合域等。利用這個(gè)標(biāo)簽可以進(jìn)行親和色譜純化以獲得目標(biāo)蛋白。部分融合系統(tǒng)中標(biāo)簽蛋白可能會(huì)干擾目標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性，可利用預(yù)先設(shè)計(jì)的特異性蛋白酶裂解位點(diǎn)切除標(biāo)簽蛋白。二、分離純化的一般過程根據(jù)外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)方式的差別以及表達(dá)蛋白本身的特性，重組蛋白的分離純化工藝各不相同。一般都包括對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理、回收菌體、細(xì)胞破碎、離心分離、樣品的濃縮與預(yù)處理、柱色譜和電泳等步驟。在分離過程中，為保證蛋白質(zhì)的生物活性，一般在低溫條件下操作，提取的條件也要盡量保持溫和。分離純化方法的選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高純化倍數(shù)和回收率。1.發(fā)酵液的預(yù)處理預(yù)處理有助于后面的操作過程，可以達(dá)到以下目的：改變發(fā)酵液的物理性提高固液分離效率；轉(zhuǎn)移產(chǎn)物至后續(xù)處理的相中；除去部分雜質(zhì)，簡(jiǎn)化后續(xù)工藝。發(fā)酵液的預(yù)處理內(nèi)容主要包括改變發(fā)酵液物理性狀(如加熱、調(diào)節(jié)PH值、絮凝等)以及改善固液分離特性(通過過濾等方法實(shí)現(xiàn)固液分離)兩類方法，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)可選擇某一種或者其中的幾種方法相結(jié)合使用。2.細(xì)胞分離(1)離心沉降法是利用固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)作相對(duì)運(yùn)動(dòng)最終實(shí)現(xiàn)固液分離的細(xì)胞分離技術(shù)。2.細(xì)胞分離(1)離心沉降法是利用固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)作相對(duì)運(yùn)動(dòng)最終實(shí)現(xiàn)固液分離的細(xì)胞分離技術(shù)。(2)過濾法主要利用多孔介質(zhì)將固液懸液中的固相顆粒截留，液體則通過介質(zhì)來實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)被分離物質(zhì)的大小可以分為一般介質(zhì)的過濾和膜過濾。3.細(xì)胞破碎對(duì)于在胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，將細(xì)胞與液態(tài)相分離后，就要考慮將細(xì)胞破碎，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)從胞內(nèi)釋放到提取液中，然后進(jìn)行目的產(chǎn)物的純化。常用的細(xì)胞破碎方法包括物理法、化學(xué)法和生物方法，破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而將胞內(nèi)物質(zhì)釋放到提取液中。針對(duì)不同的細(xì)胞種類和細(xì)胞的不同生長(zhǎng)狀態(tài)，可選擇適當(dāng)?shù)钠扑榉椒?。常見的破碎方法有變性劑裂解法、超聲波破碎法、機(jī)械破碎法、酶解法和反復(fù)凍融法。3.細(xì)胞破碎(1)變性劑裂解法有的細(xì)胞如果沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，破碎條件可選擇相對(duì)較溫和的變性劑進(jìn)行裂解。在破碎緩沖液中加入變性劑就可使細(xì)胞破裂。常用的變性劑包括鹽酸胍、尿素、SDS、Nonidet-40(NP-40)、吐溫等。(2)超聲波破碎法這是實(shí)驗(yàn)室常用的一種細(xì)胞破碎方法。超聲波法破碎細(xì)胞的一個(gè)明顯缺點(diǎn)是在超聲波處理過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，可能破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所以應(yīng)采取相應(yīng)的降溫措施。3.細(xì)胞破碎(3)機(jī)械破碎法該法利用外力作用將細(xì)胞破碎，最常用的就是研磨法，適合于細(xì)菌酵母和植物細(xì)胞的破碎。在研磨之前，一般加入石英砂或細(xì)玻璃珠與待破碎的細(xì)胞混合，以增大摩擦力，使細(xì)胞更容易硏碎。另外可以采取的一個(gè)措施是在硏磨前將待破碎細(xì)胞用液氮處理，在液氮中研磨既増加了細(xì)胞的脆性也提供了低溫環(huán)境，保證了蛋白質(zhì)活性。3.細(xì)胞破碎(3)機(jī)械破碎法該法利用外力作用將細(xì)胞破碎，最常用的就是研磨法，適合于細(xì)菌酵母和植物細(xì)胞的破碎。在研磨之前，一般加入石英砂或細(xì)玻璃珠與待破碎的細(xì)胞混合，以增大摩擦力，使細(xì)胞更容易硏碎。另外可以采取的一個(gè)措施是在硏磨前將待破碎細(xì)胞用液氮處理，在液氮中研磨既増加了細(xì)胞的脆性也提供了低溫環(huán)境，保證了蛋白質(zhì)活性。(4)酶解法該法主要參考組成細(xì)胞壁的物質(zhì)分子特點(diǎn)，利用能降解細(xì)胞壁的酶將菌體細(xì)胞壁破壞，使細(xì)胞暴露在低滲溶液或者含變性劑的溶液中從而破裂。3.細(xì)胞破碎(5)反復(fù)凍融法該法利用生物組織經(jīng)冰凍后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹從而破壞細(xì)胞。具體操作方法是將細(xì)胞在-20℃以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次后，大部分細(xì)胞都可被破碎。4.離心分離離心是基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化的重要步驟，包括高速離心和超速離心。高速離心的離心力一般在10000g的范圍以內(nèi)，主要用來去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞壁碎片等。經(jīng)過高速離心后細(xì)胞膜碎片和細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白等主要存在于上清液中。如果基因表達(dá)產(chǎn)物是小分子可溶性蛋白，還可以進(jìn)行超速離心(10000以上)以除去細(xì)胞膜碎片等雜質(zhì)。5.柱色譜根據(jù)蛋白質(zhì)的不同用途，需要對(duì)表達(dá)的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，而柱色譜技術(shù)是蛋白質(zhì)分離純化的重要手段。色譜法(chromatography)包括凝膠過濾色譜、離子交換色譜、疏水色譜、親和色譜、吸附色譜、金屬鏊合色譜以及共價(jià)色譜等。6.電泳電泳不僅是檢測(cè)蛋白質(zhì)的重要手段，在實(shí)驗(yàn)室也可以作為少量制備或純化蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。PAGE可分為Native和SDS兩種，前者主要用于不能變性的表達(dá)蛋白的分離與純化，后者則用于可通過變性的方法作進(jìn)一步純化的特異性表達(dá)蛋白。三、包涵體的溶解和重組蛋白的復(fù)性在外源基因的原核表達(dá)中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集形成不溶性蛋白質(zhì)晶狀物，稱為包涵體(inclusionbody)。三、包涵體的溶解和重組蛋白的復(fù)性在外源基因的原核表達(dá)中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集形成不溶性蛋白質(zhì)晶狀物，稱為包涵體(inclusionbody)。包涵體是不具有膜結(jié)構(gòu)的非晶體性蛋白質(zhì)聚集體。在偏振光顯微鏡或電子顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)包涵體與細(xì)胞質(zhì)的明顯區(qū)別。三、包涵體的溶解和重組蛋白的復(fù)性在外源基因的原核表達(dá)中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集形成不溶性蛋白質(zhì)晶狀物，稱為包涵體(inclusionbody)。包涵體是不具有膜結(jié)構(gòu)的非晶體性蛋白質(zhì)聚集體。在偏振光顯微鏡或電子顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)包涵體與細(xì)胞質(zhì)的明顯區(qū)別。目前上市的重組蛋