12株杜鵑類菌根真菌對桃葉杜鵑無菌實生幼苗的促生效應(yīng)

12株杜鵑類菌根真菌對桃葉杜鵑無菌實生幼苗的促生效應(yīng)

作為一種新型高效、低效環(huán)保肥料，環(huán)保新肥料已成為進(jìn)一步研究的熱點。許多木本植物接種菌根菌后能有效地提高植株光合速率并促進(jìn)生物量的積累,從而促進(jìn)了植物生長。葉綠素?zé)晒庠谥参锸艿江h(huán)境脅迫下對光合生理的影響具有較強的敏感性,因此被認(rèn)為是一種公認(rèn)的光合探針。近年來,葉綠素?zé)晒鈪?shù)成為預(yù)測植物生長勢的重要指標(biāo)之一。外生菌根與叢枝菌根的研究在我國已經(jīng)成熟,但菌根真菌侵入植物形成共生菌后,植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)如何變化的研究較少。高悅和吳小芹(2010)研究了6種外生菌根菌接種3種松樹,明顯提高了針葉的葉綠素含量及主要的熒光參數(shù),且各菌株與對照差異達(dá)顯著水平。高山常綠杜鵑生長極慢,其原因可能與該物種分布的生境特征有重要關(guān)聯(lián)性,也可能與根際微生物如菌根(Mycorrhiza)的形成有關(guān)。杜鵑花類菌根(Ericoidmycorrhiza,ERM)對杜鵑花類植物克服惡劣環(huán)境、加強養(yǎng)分吸收和提高生長量起著重要作用,ERM在我國的研究才剛剛開始,有關(guān)ERM對杜鵑花光合生理的影響鮮見報道。桃葉杜鵑(RhododendronannaeFranch.)為杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木,分布于貴州海拔1800-1830m的高山地區(qū),花色豐富,以粉紅為主,花期5-6月,是一種觀賞潛力很大的園林綠化樹種。本文研究不同的真菌菌株對桃葉杜鵑生長、光合特性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響,為菌根真菌促進(jìn)幼苗生長光合生理機(jī)制提供理論依據(jù),并在探索該物種的ERM共生適應(yīng)機(jī)理上具有重要的理論意義。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1blast同源比對鑒定試驗所采用的12個供試菌株分離自野生桃葉杜鵑根系中。真菌菌株的rDNAITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增和測序引物為通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后(由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)提交至GenBank進(jìn)行BLAST同源比對鑒定。分離菌株培養(yǎng)液為PDA培養(yǎng)基,置于28°C搖床上振蕩(160r/min)暗培養(yǎng)15d,打碎并制成液體菌劑備用。1.1.2樹石粒的測定試驗苗為實驗室通過種子和土壤滅菌后培養(yǎng)的2a生實生桃葉杜鵑苗。培養(yǎng)基質(zhì)為腐殖質(zhì)土,采自百里杜鵑風(fēng)景區(qū)桃葉杜鵑林下,將土樣分別裝入采集袋中,帶回實驗室,仔細(xì)分檢出樹根、石粒等雜物,風(fēng)干,磨碎。土壤理化性質(zhì)試驗結(jié)果:pH(水)4.75,有機(jī)質(zhì)44.10g/kg,全氮1.54g/kg,全磷0.163g/kg,堿解氮268.52mg/kg,有效磷7.00mg/kg,速效鉀205.96mg/kg。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1田間接種處理接種與育苗試驗。育苗基質(zhì)經(jīng)1×105Pa蒸汽滅菌2h,自然冷卻后繼續(xù)80°C烘2h。放置室溫后裝入花盆(規(guī)格24cm×16cm×20cm),每個花盆裝基質(zhì)3kg,每盆移植一株桃葉杜鵑幼苗。接種處理采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計,試驗設(shè)13個處理(含對照CK),每處理30盆,3次重復(fù)。幼苗上盆前用自來水沖洗干凈后用0.1%KMnO4消毒2h,然后用無菌水清洗3遍后置于處理菌液里浸泡10min,以浸泡未接菌培養(yǎng)液對照。移栽3d后每株苗根部各施入真菌液體菌劑10mL,以澆未接菌培養(yǎng)液為對照,以后每隔7d澆一次菌液,連續(xù)澆3次結(jié)束,試驗處理嚴(yán)格保證土壤微生物區(qū)系一致。接種后隨機(jī)放置,按照常規(guī)育苗方法進(jìn)行管理。1.2.2觀察組和方法每處理隨機(jī)取5株幼苗根系共30根段,每根段8mm左右長進(jìn)行菌根侵染觀測,采用酸性品紅染色鏡檢法,步驟采用Komanik等(1980)方法:洗根—透明—漂洗—軟化—酸化—染色—脫色,3次重復(fù)。菌根侵染率(%)=(菌根侵染的根段長度/檢測的根段總長度)×100。1.2.3酶系統(tǒng)生物量及菌根依賴率測定隨機(jī)選擇處理幼苗5株,洗凈根系土壤,80°C、48h烘干至恒重,稱量測定烘干后的地下和地上部分生物量,計算總生物量及菌根依賴性,3次重復(fù)。菌根依賴性MD=(接種植株平均干重/對照植株平均干重)×100%。1.2.4光化學(xué)活性測定采用基礎(chǔ)型調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xJUNIOR-PAM(WALZ,德國)于2012年8月10日上午8:00-11:00進(jìn)行活體測定。測定時選取各處理菌根苗生長一致且受光方向相同,生長完好,無病蟲害,葉面積相近的第4片葉片,測定初始熒光Fo、最大熒光Fm、可變熒光Fv(Fv=Fm-Fo)、實際量子產(chǎn)量ΦPSⅡ、表觀電子傳遞速率ETR、PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(即最大光化學(xué)活性)Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo、光化學(xué)淬滅qP、非光化學(xué)淬滅NPQ。其中Fo、Fm、Fv/Fm測定前將葉片暗適應(yīng)20min。每測量指標(biāo)重復(fù)6株,每株固定1片葉片。1.2.5桃葉不同部位的光合特性選擇葉片與重復(fù)數(shù)同前,于2012年8月11日上午8:00-11:00,使用LI-6400(LI-Cor.,美國)便攜式光合測定儀測定桃葉杜鵑菌根苗葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)。測定時葉室配備LED紅藍(lán)光源,光量子通量密度(PFD)為1000μmol/(m·s),CO2濃度為400μmol/mol,溫度為27°C。1.2.6測定了藍(lán)色信號的含量1.3統(tǒng)計分析方法數(shù)據(jù)使用Excel2003記錄及繪圖,使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan多重比較法分析不同菌株對苗木各項生長、生理指標(biāo)進(jìn)行方差檢驗(P=0.01)。2結(jié)果與分析2.1blast同源比對菌根真菌rDNA-ITSPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后提交至GenBank進(jìn)行BLAST同源比對。經(jīng)比對,初步確定本試驗的12個菌株中的11個菌株可能分別為6個不同的真菌種(表1),菌株TY18未能獲得比對結(jié)果。2.2不同時期植物的桃葉杜鵑幼苗的根污染率從圖1可以看出,接種苗菌根侵染率達(dá)到45.04%-74.14%。2.3不同菌株對桃葉植物根火炬苗總生物量和地上部分干重的影響從圖2可知,接種苗的依賴性均大于100%,最高達(dá)到161%。相關(guān)性分析得知,侵染率與依賴性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.901**),驗證了真菌的侵染是產(chǎn)生菌根效應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)。從圖3可以看出,接種苗幼苗的地上部分、地下部分干重與總生物量均較對照提高。菌株接種對幼苗的地上部分干重影響大于地下部分干重?？偵锪砍齌Y07和TY41外,其余菌株處理均與對照差異極顯著(P<0.01),接種苗生物量比對照增長了1.039-1.612倍。不同菌株對桃葉杜鵑根系親和力的差異性,反映出宿主對各菌根菌株的不同依賴性。TY18、TY29、TY35、TY02、TY07、TY12等菌株對幼苗的促生效應(yīng)較大。2.4葉綠素a/b含量葉綠素是植物光合作用過程中主要吸收光能的物質(zhì)色素,直接影響植物光合作用的光能利用。不同菌株處理后桃葉杜鵑幼苗葉片葉綠素含量不同(圖4-7)。接種苗葉片中葉綠素a含量均高于對照,增加倍數(shù)為1.647-2.331,且與對照差異極顯著(P<0.01)。菌根幼苗葉片葉綠素b含量均高于對照,增加倍數(shù)為1.545-2.969,且與對照差異極顯著(P<0.01)。不同菌根總?cè)~綠素均高于對照,增加倍數(shù)為2.430-1.713,且與對照差異極顯著(P<0.01)。菌株TY14、TY24、TY34和TY41處理幼苗葉片葉綠素a/b高于對照,其它菌株處理葉綠素a/b含量低于對照。葉綠素含量是反映植物光合能力的一個重要指標(biāo),葉綠素含量越高表明幼苗對光的利用率越強,桃葉杜鵑幼苗接種后葉綠素的增加有利于捕獲光能,葉綠素a/b含量低于對照說明接種后幼苗葉片葉綠素b的增長大于葉綠素a的增長。2.5葉片光合速率及氣孔導(dǎo)度從圖8-11可以看出,不同菌株接種桃葉杜鵑幼苗葉片凈光合速率Pn除TY21外均高于對照,且差異極顯著(P<0.01)。葉片蒸騰速率Tr、葉片氣孔導(dǎo)度Gs均高于對照。葉片胞間CO2濃度Ci均低于對照。2.6不同菌株對ps光化學(xué)傳遞的活性檢測不同菌株接種對桃葉杜鵑幼苗葉片葉綠素?zé)晒庵饕獏?shù)ΦPSⅡ、ETR、Fv/Fm、Fv/Fo、qP、NPQ的影響情況見表2。桃葉杜鵑菌根苗ΦPSⅡ除菌株TY19、TY24和TY34低于對照外,其余均極顯著高于對照(P<0.01)。較高的ΦPSⅡ值,有利于提高光能轉(zhuǎn)化效率,為暗反應(yīng)的光合同化積累更多所需的能量,以促進(jìn)碳同化的高效運轉(zhuǎn)和有機(jī)物的積累。接種真菌提高桃葉杜鵑幼苗葉片的ΦPSⅡ,說明菌根苗能提高葉片的實際光化學(xué)效率,有效提高原初光能捕獲效率,進(jìn)而為光合碳同化提供充足的還原力。試驗表明不同的菌株對ΦPSⅡ的影響是不一樣的,ΦPSⅡ值越大,說明葉片的實際光化學(xué)效率越高,菌株TY35處理苗的葉片ΦPSⅡ最大,比對照提高79.93%。ETR能明顯地表明PSⅡ利用光能的能力。不同菌根桃葉杜鵑幼苗葉片的PSⅡ電子傳遞速率ETR均比對照提高,且差異極顯著(P<0.01)。PSⅡ的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm值常用于度量植物葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率,它反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率,即反映植物的潛在最大光合能力。菌根幼苗葉片的Fv/Fm均高于對照,除TY21和TY34外其余菌株與對照差異極顯著(P<0.01);從增長幅度來看,TY35處理幼苗葉片F(xiàn)v/Fm增長最大,比對照增加了56.88%;其次為TY18,比對照增加了53.27%;TY24增加的幅度也較高,比對照增加了39.73%;其它菌株增加值在5.64%-20.00%之間。較高的Fv/Fm值說明菌根苗可能將葉片所吸收的光能有效地轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,以提高光合電子傳遞速率,形成更多的ATP和NADPH,為光合碳同化提供充分的能量和還原力。PSⅡ潛在活性Fv/Fo反映經(jīng)過PSⅡ的電子傳遞情況。菌根幼苗葉片的Fv/Fo除菌株TY21和TY34外均高于對照;從增長幅度來看,菌株TY12、TY18、TY29、TY35增長較大,增長幅度在58.00%-83.99%之間(P<0.01)。光化學(xué)淬滅q反映了植物光合活性的高低,qP值的大小反映的是原初電子受體QA的氧化性,值越大說明電子傳遞活性越大。非光化學(xué)淬滅NPQ反映了植物耗散過剩光能為熱的能力。從表2中可以看出,菌根幼苗葉片的光化學(xué)淬滅qP均大于對照,除菌株TY19、TY21、TY24外,其它菌株與對照差異極顯著(P<0.01);菌株TY35增加最大,是對照的3.31倍。不同菌根幼苗葉片的非光化學(xué)淬滅NPQ除菌株TY29外,其它菌株處理的NPQ均高于對照。2.7tr與fv/fm、fo、pn、tr的相關(guān)性從表3可以看出,ΦPSⅡ與Pn、Gs的相關(guān)性大于Fv/Fm、qP、NPQ。ETR與Fv/Fm、Fv/Fo、NPQ、Pn、Tr的相關(guān)性大于qP、Gs。Pn與Gs的相關(guān)性大于Tr,與Ci顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。Chl.a與Chl.b和Chl.T三者極顯著正相關(guān),與Chl.a/b極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。3桃葉帶菌根苗光合色素測定的機(jī)理光合作用是判斷植物生長和抗逆性強弱的重要指標(biāo)。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可作為菌根處理對植物光合作用影響因素的評價條件之一。PSⅡ電子傳遞速率ETR能明顯地表明PSⅡ利用光能的能力,桃葉杜鵑接種后幼苗葉片ETR的增長說明真菌接種顯著地提高了幼苗利用光能的能力。低溫和強光脅迫可導(dǎo)致Fv/Fm下降,本研究中桃葉杜鵑未接種移栽苗可以認(rèn)為是一種脅迫處理,這種人為脅迫導(dǎo)致Fv/Fm與Fv/Fo低于接種苗,與上述前人研究相似。通過相關(guān)性分析表明,接種桃葉杜鵑菌根苗ETR與PSⅡ的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm、PSⅡ潛在量子產(chǎn)量Fv/Fo呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),因此ETR增加的原因可能是接種苗Fv/Fm與Fv/Fo的增加所引起的。也有研究指出Fv/Fm在滲透脅迫下增加,從而導(dǎo)致ETR下降的相反結(jié)論,認(rèn)為可能是植物在受到某種脅迫(如干旱)后會產(chǎn)生適應(yīng)過程,其本身的光合作用系統(tǒng)進(jìn)行自我修復(fù)的結(jié)果。光化學(xué)淬滅qP的增加有利于提高ΦPSⅡ原狀態(tài)和PSⅡ開放中心的數(shù)目,它的值越大反映中心開放部分的比例越大,能將更多的光能用于推動光合電子傳遞,提高光合電子傳遞能力。本研究結(jié)果表明不同桃葉杜鵑菌根苗除菌株TY19、TY21和TY24外,葉片的qP顯著高于對照。熱耗散可以防御過剩光能的破壞,也就是說,PSⅡ可以通過提高非輻射性熱耗散,消耗PSⅡ吸收的過剩光能,從而保護(hù)PSⅡ反應(yīng)中心免受吸收過多光能而引起的光氧化傷害,這實質(zhì)上是一種保護(hù)機(jī)制。桃葉杜鵑幼苗接種菌株后,除菌株TY29外,葉片NPQ比對照顯著提高,表明PSⅡ的潛在勢耗散能力增強,能有效地避免或減輕因PSⅡ吸收過多光能對光合機(jī)構(gòu)的破壞。有文章報道,不同環(huán)境中、不同樹種之間,qP與NPQ呈極顯著正相關(guān),也有呈負(fù)相關(guān),其原因可能是過剩光能的耗散機(jī)制發(fā)生了變化,其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。本研究中,qP與NPQ呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),原因可能與葉綠素含量的貢獻(xiàn)率有關(guān)。桃葉杜鵑幼苗接種菌株后葉片葉綠素含量極顯著高于對照,a/b含量極顯著低于對照,葉綠素含量越高表明更有利于捕獲光能和對光的利用,葉綠素a/b含量低于對照說明葉綠素b的增加大于葉綠素a。葉綠素b主要吸收藍(lán)紫光,而藍(lán)紫光量子所持的能量大于紅光所持有的,這樣,植株第一單線態(tài)與第二單線態(tài)(即激發(fā)態(tài))擁有的量子就多,熱形式與光形式消耗的能量也就增多,因此,本研究中葉綠素b的增加可能是qP和NPQ增加的原因之一。趙昕等報道了喜樹幼苗接種AM真菌其葉片葉綠素a/b顯著高于無菌根幼苗,與本文研究相反,但接種對幼苗的qP和NPQ影響不確定,這可能與不同植物對光強的響應(yīng)和菌根真菌類型不同從而對光合色素的化學(xué)特性影響不同有關(guān)。桃葉杜鵑菌根幼苗葉片Pn、Tr、Gs極顯著增長,Ci極顯著低于對照。經(jīng)過相關(guān)性分析,Pn與Gs的正相關(guān)顯著性大于Tr,因此,引起葉片Pn差異其中一個原因可能是由于Gs的不同造成的,氣孔行為可能是桃葉杜鵑菌根苗光合作用碳固定的控制因素之一。導(dǎo)致Gs升高的原因可能是菌根苗體內(nèi)激素調(diào)節(jié)了氣孔開關(guān)或者是真菌加強了水分和其它營養(yǎng)成分的吸收與轉(zhuǎn)動,從而有利于菌根苗的氣體交換。由于Pn與Gs增加的同時,Ci卻在下降,所以在接種處理下,氣孔限制不是導(dǎo)致光合作用上升的主導(dǎo)作用。通過相關(guān)性分析得知,ΦPSⅡ和ETR分別與Pn呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),因此ΦPSⅡ和ETR的增長可能是共同導(dǎo)致Pn非氣孔限制因素增長的原因之一。一般情況下,葉綠素含量增加,Pn同樣會增長,本文中Chl.a、Chl.b和Chl.T與Pn極顯著正相關(guān)(P<0.01),印證了葉綠素含量增加是Pn增長的另一個非氣孔限制因