黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化

黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化

木聚糖酶是一種半纖維水解酶。近年來，木聚糖酶及其解決方案在造紙、飼料和食品行業(yè)中的作用日益受到國內(nèi)外的關(guān)注，并具有廣闊的應(yīng)用前景。由于木聚糖酶的生產(chǎn)成本較高,木聚糖價(jià)格又較貴,如何利用廉價(jià)的半纖維素材料高效生產(chǎn)木聚糖酶是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。我國具有豐富的富含半纖維素類自然資源的農(nóng)林廢棄物,長期以來未受到充分的開發(fā)利用。如能將其用于木聚糖酶的生產(chǎn),不僅可取得巨大的經(jīng)濟(jì)效益,還可以變廢為寶,保護(hù)環(huán)境。之前的一些研究主要是以玉米芯和麩皮為主要原料進(jìn)行木聚糖酶的生產(chǎn),而對(duì)玉米皮的研究很少。所以本文以玉米皮為主要原料,以黑曲霉為生產(chǎn)菌株,對(duì)產(chǎn)酶的條件進(jìn)行初步優(yōu)化,可以為工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶提供一些參考。1材料和方法1.1細(xì)菌和材料菌株:黑曲霉(AspergillusnigerSD-03),東北師范大學(xué)生科院微生物教研室保存;材料:玉米皮,麩皮1.2基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基1.3酶活單位的確定DNS法測定。酶活力單位定義為:在酶與底物(木聚糖)反應(yīng)的最適條件下,每分鐘生成1umol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(IU/g)1.4酶活測定黑曲霉培養(yǎng)72h后向固體曲中加入100ml自來水充分?jǐn)嚢?然后用3層紗布過濾,濾液離心(12000r/min,4℃)20分鐘,上清液稀釋20倍后用于酶活測定。2結(jié)果與分析2.1鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響對(duì)照組為固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加Mandel鹽(A鹽10%,B鹽0.1%),水、玉米皮、麩皮量不變。滅菌、接種、培養(yǎng)三天后測定酶活,結(jié)果如下:經(jīng)過對(duì)數(shù)據(jù)分析加鹽比不加鹽的酶活提高近。說明加入鹽對(duì)產(chǎn)酶有一定的影響。因此在下面的研究中加入了鹽。2.2培養(yǎng)基濃度對(duì)黑曲霉產(chǎn)酶的影響配制5ml,15ml,25ml,35ml,45ml,55ml鹽溶液(B鹽0.1%,A鹽10%)分別加入含有9g玉米皮、1g麩皮的250ml錐形瓶中,滅菌、接種、28℃培養(yǎng)72h后測定酶活。由圖1可知當(dāng)培養(yǎng)基含水量為25ml時(shí),酶活力最高,當(dāng)超過25ml時(shí)黑曲霉的生長受到抑制,產(chǎn)酶量下降。培養(yǎng)基滅菌、接種后分別置于25℃,29℃,32℃,37℃,42℃恒溫培養(yǎng)72h用于測定酶活。由圖2可知,當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時(shí),黑曲霉生長緩慢,產(chǎn)酶較低。32℃時(shí)酶活最高,29℃時(shí)與32℃時(shí)基本持平,但是在37℃、42℃時(shí)酶活下降明顯,可見溫度太高不利于菌體生長,并且在培養(yǎng)后期也會(huì)影響培養(yǎng)基的濕度,使產(chǎn)酶降低。2.3培養(yǎng)基初始ph值對(duì)黑曲霉產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)基滅菌、接種后于28℃下培養(yǎng),從第一個(gè)24h開始取樣,每隔24h取一次,連續(xù)取10次,測定酶活。由圖3可知,當(dāng)菌株培養(yǎng)24h后酶活開始迅速上升,此時(shí)黑曲霉生長處于指數(shù)期,大量繁殖。48h~120h酶活性緩慢上升,120h~168h酶活基本持平,168h后酶活下降。故培養(yǎng)120h為最佳產(chǎn)酶時(shí)間。用適當(dāng)濃度的NaOH和Hcl溶液將培養(yǎng)基初始PH范圍調(diào)成2~10,滅菌、接種、培養(yǎng)后測定酶活。由圖4可知,PH為2~3時(shí),黑曲霉幾乎不生長,產(chǎn)酶量極其低,PH在4~7范圍內(nèi)酶活基本持平,PH值達(dá)到8時(shí)酶活有所下降,若PH值繼續(xù)升高,酶活顯著下降。經(jīng)測定此實(shí)驗(yàn)所用固體基本培養(yǎng)基PH約為5,故在生產(chǎn)過程中,為了節(jié)省時(shí)間、提高產(chǎn)率,選用固體基本培養(yǎng)基的自然PH值。2.4最適接種量為20將106個(gè)/ml的孢子懸液按0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml的接種量接種到滅好菌培養(yǎng)基中。28℃培養(yǎng),72小時(shí)后測定酶活。由圖5可知,當(dāng)接種量為0.1ml、0.5m時(shí)酶活較低,當(dāng)接種量達(dá)到1ml后酶活基本持平,2ml達(dá)到峰值,酶活最高。綜合考慮,最適接種量為2ml。取氮源為0.1%NH4NO3,0.15%(NH4)2SO4,0.15%NH4Cl,0.25%NaNO3,0.2%蛋白胨,0.2%酵母膏,0.2%牛肉膏,0.8%黃豆粉,(以上百分?jǐn)?shù)均已含氮元素量為準(zhǔn))分別溶于12.5ml蒸餾水中再分別加入0.025mlB鹽和2.5ml無氮A鹽,混勻后加入到裝有9g玉米皮和1g麩皮的250ml錐形瓶中,攪拌。對(duì)照組為固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(加2.5ml無氮A鹽,0.025mlB鹽)與上述實(shí)驗(yàn)組同時(shí)滅菌、接種、培養(yǎng)、測定酶活。據(jù)圖6可知,無機(jī)氮源中(NH4)2SO4可大大提高酶活力,有機(jī)氮源中黃豆粉的效果最佳。生產(chǎn)中,為降低成本,在基本培養(yǎng)基中加入(NH4)2SO4。2.5正交試驗(yàn)結(jié)果在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接種量設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表(表2),以木聚糖酶酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)做正交試驗(yàn),結(jié)果見表3。由表3可知,影響木聚糖酶產(chǎn)生水平的主次因素順序?yàn)?B>A>C>D,即培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基含水量>培養(yǎng)時(shí)間>接種量;得出的最優(yōu)工藝組合為A2B1C2D3,即培養(yǎng)基含水量25ml、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間120h、接種量2ml。在此工藝條件下,木聚糖酶酶活力可達(dá)2232IU/g。3最適產(chǎn)酶條件及接種量通過對(duì)固體培養(yǎng)基不同的單因素及正交試驗(yàn)的研究,得到了產(chǎn)酶最佳條件,然后經(jīng)過最佳條件的優(yōu)化組合得到優(yōu)化后的酶活力。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究,該菌株的最適產(chǎn)酶條件如下:麩皮與玉米皮的質(zhì)量比為1:9,加Mandel鹽,氮