犢牛超排生產胚胎和胚胎移植研究

犢牛超排生產胚胎和胚胎移植研究

0同卵雙胎桑胚人工誘導繁殖技術西門塔爾牛（borissen）是由瑞士西門塔爾牛和德系紅景天混合而成的。整個育種過程有近150年的歷史,特別是從20世紀80年代到現(xiàn)在,經過20多年的定向選育,逐步形成了特有的乳肉兼用的西門塔爾品系,具有較高的經濟效益。該品系的主要特征是:遺傳穩(wěn)定,母牛產奶性能好,公牛育肥能力強,耐粗飼,抗病力強。據報道,德系西門塔爾牛與荷斯坦奶牛相比,與其他的牛進行雜交后,更能體現(xiàn)出其優(yōu)越性,對改良中國奶牛、肉牛具有積極的意義。胚胎移植技術主要包括超數(shù)排卵、同期發(fā)情、胚胎移植等環(huán)節(jié),目前已基本成為一項比較成熟的生物技術,能夠充分挖掘優(yōu)秀母畜的繁殖潛力,使母畜繁殖力提高幾倍甚至10幾倍,從而在短時間內迅速擴大優(yōu)良種群,加速畜群改良和純種繁育進程,也是迅速提高中國牛群整體水平的重要而有效的手段。近20年來,通過分割哺乳動物的早期胚胎來人工產生遺傳上完全相同的同卵雙胎或多胎動物,在綿羊、牛、小鼠、大鼠、馬、兔、豬等哺乳動物中已廣為開展,為生產上提供了具有優(yōu)良品種(產肉、產奶量高等)的動物。早在1959年,Tarkowski發(fā)現(xiàn)一半卵裂球已被破壞的2-細胞小鼠胚胎可以發(fā)育成囊胚,并出生了小鼠。1980年,Willadsen用瓊脂包埋分割的綿羊2、4、8-細胞期胚胎,使半胚在中間受體內發(fā)育時受到保護,并防止其內的卵裂球分散,取得了近似正常的妊娠率(66%)。但此方法較復雜,很難在生產上推廣應用。1984年改進了方法,分割較晚期的胚胎(桑葚胚或胚泡),分割后的胚胎立即移植,因而具有很大的實用價值。近年來,科學家們仍在尋求更加簡便、完善的胚胎分割和培養(yǎng)方法,以提高胚胎分割的效率。在哺乳動物尤其是大型農場動物進行良種繁殖時,可用胚胎分割方式增加胚胎數(shù)目及人造同卵雙胎和多胎數(shù)目,移植后便可獲得更多的良種。目前,在家畜特別是經濟價值較高的牛中,胚胎分割已成為常規(guī)技術在商業(yè)胚胎移植中應用,增加胚胎數(shù)目,移植后獲得更多的良種。集成胚胎移植相關環(huán)節(jié)技術和胚胎分割技術,用于發(fā)展德系西門塔爾?；A母牛群,目的是加快德系西門塔爾牛的繁育速度,在短時間內迅速擴繁德系西門塔爾牛核心群,現(xiàn)把有關方法和結果報告如下。1材料方法1.1時間和地點2009年5月—2010年2月于河北省張北縣華田牧業(yè)科技有限公司進行。此期間共沖胚4次,移植6次。1.2受影響的牛供體牛為健康,無生殖和傳染性疾病,營養(yǎng)狀況較好的純種德系西門塔爾牛13頭。受體牛為本地黃牛,營養(yǎng)狀況良好,無生殖和傳染性疾病。1.3藥物和機器試驗所需藥品及儀器與耗材見表1和表2。1.4fsh的肌肉注射超排處理方案:在發(fā)情周期的任何一天上午給供體牛放置(CIDR+土霉素粉),同時肌肉注射維生素ADE注射液10mL/頭,當日為第0天。從第5天上午開始到第8天下午,分別在每天上午7:00和下午7:00分2次,遞減注射FSH,總劑量10mg。在第5、6次注射FSH的同時肌肉注射PGF2α0.6mg/頭。第8天上午撤拴,并且用0.9%的生理鹽水沖洗陰道,下午注射維生素ADE注射液10mL/頭。第9天開始觀察發(fā)情,并做好記錄,發(fā)情后12h配種同時肌肉注射促排3號25μg/頭,24h第2次配種。配種后7天沖胚。1.5pgf20.6.6m受體同期發(fā)情處理的方法(CIDR+PG法):受體牛發(fā)情周期的任何一天上午放CIDR,并肌肉注射維生素ADE5mL/頭,記為第0天,第9天上午7:00注射PGF2α0.6mg/頭,并肌肉注射維生素ADE5mL/頭,第12天上午7:00撤去CIDR,第13天觀察發(fā)情并做好記錄,第21天移植。1.6顯微手術刀的制備采用顯微操作儀進行胚胎分割。(1)調節(jié)顯微手術刀:使刀面垂直于分割皿底面,刀刃線與分割皿底面接近平行,刀尖略低。(2)清洗消毒顯微手術刀:用4個φ35mm培養(yǎng)皿分別加入超純水、95%乙醇、超純水、胚胎分割液(Splitting),每次分割胚胎前按順序清洗顯微手術刀1遍。(3)待分割胚胎的準備:在φ60mm培養(yǎng)皿的蓋或底上做分割液滴(50~70μL),將枚胚胎從Holding液中取出,在胚胎分割液中洗2~3次后放入分割液滴中,準備分割。(4)胚胎分割和回收:將顯微手術刀的尖端部置于欲分割的胚胎上面,以刀尖剛探出胚胎為宜,對準胚胎的正中平分線徐徐下壓,即可將1個胚胎分割成兩半((1)最好選用桑葚胚胎或早期囊胚;(2)分割時,切不可將顯微手術刀迅速壓下以免損傷胚胎)。分割后的胚胎用吸有Holding液的吸管進行回收,并讓分割后胚胎進行恢復,待移植使用。1.7保證了體外受精神質的保證直腸檢查發(fā)情后7~8天的受體,選擇黃體發(fā)育良好的受體牛進行移植;胚胎裝管采用4段法,操作室溫度控制在25℃左右,將胚胎移植到有黃體的一側子宮角,并保證胚胎發(fā)育階段與受體牛發(fā)情周期的同步性。雙半胚移植是將一對半胚同時移植到有黃體的一側子宮角,方法與單胚移植相同。胚胎移植后70~90天采用直腸檢查法對受體牛進行妊娠檢查。1.8數(shù)據計數(shù)平均回收胚數(shù)、平均可用胚數(shù)、平均退化胚數(shù)與平均未受精卵數(shù)采用SPSS15進行方差分析;移植妊娠率、流產死胎率采用χ2分析。2結果與分析2.1冷凍胚胎和鮮胚移植2009年5月1日—10月20日,13頭20月齡德系西門塔爾供體牛經過4次超排處理獲得胚胎654枚(頭均50.31枚),其中可用胚胎335枚(頭均25.77),4次共冷凍胚胎174枚,移植鮮胚161枚。供體牛4次超排有效率均為100%,平均可用胚數(shù)第4次最高(8.50枚),第2次最低(6.00枚),但各組間差異不顯著(P>0.05),見表3。2.2半胚與鮮雙半胚妊娠率比較從2009年5月—2010年2月共處理受體牛385頭次,移植278頭次(見表4),受體利用率為72.21%(鮮胚移植115頭,凍胚移植118頭,雙半胚移植45頭),妊娠153頭,妊娠率55.04%,共獲得犢牛137頭。其中鮮雙半胚和鮮胚移植妊娠率顯著高于凍胚(64.44%,60.87%vs45.76%)(P<0.05),以鮮雙半胚妊娠率最高。鮮雙半胚的流產死胎率為37.93%,顯著高于凍胚流產死胎率7.41%(P<0.01)和鮮胚流產率17.14%(P<0.05)。45枚鮮胚二分后移植到45頭受體牛,29頭妊娠,其中11頭產雙胎,雙犢率為37.93%(11/29),存活犢牛29頭。3受體牛超排、妊娠率高國內外目前還沒有胚胎移植技術在德系西門塔爾牛應用的報道。趙鑫等報道西門塔爾母牛經過1個情期的生殖與體況的恢復,其卵巢機能基本恢復到超排前的狀態(tài),重復超排是可行的。在表3中,前3次供體牛重復超排獲得的平均可用胚胎數(shù)(7.46枚、6.00枚、7.08枚)無顯著差異(P>0.05),結果表明(CIDR+PG)法對德系西門塔爾牛重復超排可行,且能獲得較好的超排效果。有研究報道,根據前1次超排效果有選擇性地對供體牛進行重復超排可以獲得穩(wěn)定的超排效果,有效地提高供體牛利用率,降低胚胎生產成本。因此,綜合考慮供體牛的繁殖狀況和前3次的沖胚效果,5頭供體牛在第4次未進行超排處理,表3結果顯示第4次平均可用胚數(shù)最高(8.50枚),超排有效率仍為100%,與前3次均無顯著差異(P>0.05)。結果驗證了選擇性對供體牛重復超排是一種提高供體牛利用率,降低胚胎生產成本的有效方法。采用(CIDR+PG)法對受體牛同期發(fā)情處理,受體利用率為72.21%(278/385),結果與趙智勇等報道的相同。表4中,鮮雙半胚和鮮胚移植妊娠率顯著高于凍胚(64.44%,60.87%vs45.76%)(P<0.05),以鮮雙半胚妊娠率最高,這與吳柱月等、魏建生等報道結果相似。采用直接分割法,分割成活率達100%,獲得的雙半胚較單一全胚移植妊娠率高,主要是因2枚半胚有較多的滋養(yǎng)層細胞發(fā)育,增強了妊娠識別信號,為胚胎存活奠定了基礎。表4中45枚鮮胚二分后移植到45頭受體牛,29頭妊娠,其中11頭產雙胎,雙犢率為37.93%(11/29),存活犢牛29頭,半胚產犢率為32.22%(29/90)。若按未分割的整胚計算,產犢率提高到64.44%(29/45),比整鮮胚移植的產犢率50.43%(58/115)提高14.01個百分點,結果與桑潤滋等研究報道一致。據報道,懷雙胎的母牛更需要較高的營養(yǎng)水平以滿足胎兒的生長發(fā)育,否則胎兒因得不到足夠的營養(yǎng),而造成懷孕母牛流產。表4中,鮮雙半胚的流產死胎率為37.93%,顯著高于凍胚流產死胎率7.41%(P<0.01)和鮮胚流產率17.14%(P<0.05)。因此,此次鮮雙半胚流產率較高的原因是否由于飼養(yǎng)管理模式沒有根據受體牛移植情況及時調整而造成,還有待進一步研究。也有研究報道,西門塔爾牛屬中大型牛,受體牛應選擇體形較大的的雜交牛會比本地牛產犢效果好。4項目的繁殖效果2009年5月—2010年2月,13頭德系西門塔爾牛共獲得可用胚胎335枚,頭均達到了25.77枚,移植受體移植278頭次(其中雙半胚移植45頭),截止到2010年11月共獲得犢牛137頭。