基因工程原理與技術(shù)（第四版）課件 第5、6章 目的基因克隆、原核細(xì)胞基因工程

第五章目的基因克隆目的基因（targetgene）：

是指基因工程中待研究或待克隆的基因。目的基因的克隆就是利用分子生物學(xué)及基因工程手段獲得目的基因的過(guò)程，它是實(shí)施基因工程的基本前提之一。3目的基因的克隆主要包括兩種策略：一種是在基因序列已知的基礎(chǔ)上，通過(guò)PCR擴(kuò)增、改造或者人工化學(xué)合成的方法獲得目的基因；另一種是構(gòu)建大容量或者經(jīng)特定手段優(yōu)化的基因文庫(kù)，然后利用一定的篩選方法從中分離、鑒定出需要進(jìn)行研究的目的基因。4第一節(jié)PCR擴(kuò)增法獲得目的基因第二節(jié)基因的合成第三節(jié)基因組DNA的克隆第四節(jié)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及篩選

第五節(jié)差異克隆技術(shù)第六節(jié)DNA誘變第七節(jié)轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定本章內(nèi)容生物信息學(xué)分析目的基因序列未知序列已知PCR基因合成PCR基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因文庫(kù)突變體庫(kù)目的基因序列已知PCRPCR技術(shù)（原理）模板DNA95℃變性55℃退火72℃延伸25-30次循環(huán)目的片段擴(kuò)增2n倍（1）引物長(zhǎng)度：引物長(zhǎng)度約為20-25bp左右。GC含量太低時(shí)，長(zhǎng)度可以達(dá)到30bp，太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長(zhǎng)比較浪費(fèi)，且容易出錯(cuò)難以合成。（2）引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。（3）Tm值應(yīng)以大于60-70℃為宜，Tm值太低可能會(huì)降低特異性，可通過(guò)適當(dāng)增加引物長(zhǎng)度來(lái)調(diào)整。（4）引物3‘-端的堿基最好為GC，這樣可以增加退火溫度和特異性。（5）ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（6）引物5‘-端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、缺失或插入突變位點(diǎn)等序列，以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，通常應(yīng)在限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。（7）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3‘-端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則目的基因序列已知PCR基因合成隨著技術(shù)的發(fā)展，用化學(xué)的方法人工合成基因成為可能，人工合成的基因可以是生物體內(nèi)已經(jīng)存在的，也可以是按照人們的愿望和特殊需要重新設(shè)計(jì)的。1970年，美國(guó)麻省理工學(xué)院Khorana等人首次報(bào)道了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的全人工合成基因。第二節(jié)基因的合成隨著技術(shù)的發(fā)展，用化學(xué)的方法人工合成基因成為可能，人工合成的基因可以是生物體內(nèi)已經(jīng)存在的，也可以是按照人們的愿望和特殊需要重新設(shè)計(jì)的。1970年，美國(guó)麻省理工學(xué)院Khorana等人首次報(bào)道了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的全人工合成基因。DNA的合成方法有液相磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法，以及在后兩者基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的固相的磷酸三酯法和亞磷酸三酯法及自動(dòng)合成法。第二節(jié)基因的合成利用人為操縱的化學(xué)反應(yīng)，使核苷酸間形成正確聯(lián)接發(fā)展歷史：H-亞磷酸酯→磷酸二酯法→磷酸三酯法→亞磷酸三酯法固相亞磷酸三酯法：目前最通用的一種合成寡核苷酸的方法，是在偶聯(lián)于固相支持物上的連接臂末端通過(guò)逐個(gè)加上核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其一個(gè)合成循環(huán)周期分為四個(gè)步驟——去保護(hù)(deprotection)、偶聯(lián)（coupling）、封端（capping）、氧化（oxidation）。一、DNA人工合成的原理固相載體二甲氧基三苯甲基偶連（四唑）封端（乙酸酐）去保護(hù)（酸）氧化（碘液）1、退火-連接法2、多步退火-延伸-連接法3、由內(nèi)向外多步退火-延伸合成法

基因的人工合成是在寡核苷酸化學(xué)合成的基礎(chǔ)上建立的，通常的策略是將需要合成的基因分成若干個(gè)相互重疊的片段，先利用化學(xué)合成法分別合成這些小片段，然后讓這些片段退火配對(duì)，最后利用連接酶和聚合酶將這些片段連接成完整的基因序列。DNA小片段→全長(zhǎng)基因二、人工合成基因功能蛋白的外源宿主表達(dá)是現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)，然而很多蛋白由于可能包含有抑制表達(dá)的因子：如有機(jī)體使用了不常用的密碼子等，在外源宿主中很難表達(dá)。日益發(fā)展的基因設(shè)計(jì)與合成技術(shù)使通過(guò)基因設(shè)計(jì)改善蛋白表達(dá)成為可能，例如，可以通過(guò)基因設(shè)計(jì)使基因與宿主的密碼子使用頻率相匹配來(lái)提高蛋白表達(dá)水平?；蛟O(shè)計(jì)不僅包括密碼子優(yōu)化，還包括mRNA結(jié)構(gòu)修正、翻譯起始位點(diǎn)的優(yōu)化等。密碼子優(yōu)化目的基因序列未知序列已知PCR基因合成基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因文庫(kù)生物信息學(xué)分析PCR突變體庫(kù)基因文庫(kù)基因文庫(kù)是指在規(guī)定的概率水平上包含特定DNA片段的重組子集合，其中每一個(gè)重組子攜帶一個(gè)DNA片段。根據(jù)DNA片段的來(lái)源可分為基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，而根據(jù)克隆載體的不同可分為質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、酵母人工染色體文庫(kù)等。在建立了成千上萬(wàn)個(gè)無(wú)性繁殖的大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物或其他生物基因組片段的基因文庫(kù)之后，研究者可以從中篩選克隆任何一種目的基因，而不必再重復(fù)地進(jìn)行整個(gè)無(wú)性繁殖的操作。21第三節(jié)基因組DNA的克隆基因組文庫(kù)的構(gòu)建包括載體的選用、高分子量DNA的制備、外源DNA片段與載體分子的連接重組、重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞、陽(yáng)性克隆的篩選以及對(duì)基因組文庫(kù)的評(píng)價(jià)和鑒定等步驟。一、基因組文庫(kù)的構(gòu)建和檢測(cè)第三節(jié)基因組DNA的克隆載體選擇載體容量（Kb）宿主穩(wěn)定性DNA制備pBR326-10E.coli+易pUC18/196-10E.coli+易柯斯質(zhì)粒載體33~45E.coli+易Fosmid35-45E.coli+易YAC載體100-2000E.coli,酵母-難BAC載體100-300E.coli+易P1噬菌體載體70-100E.coli-易（1）

載體的選擇和制備獲得高分子量的染色體DNA是構(gòu)建完整DNA文庫(kù)的基礎(chǔ)。適當(dāng)?shù)叵拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化處理。（2）高分子量DNA的準(zhǔn)備獲得高分子量的染色體DNA是構(gòu)建完整DNA文庫(kù)的基礎(chǔ)。適當(dāng)?shù)叵拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化處理。分離方法有：瓊脂糖凝膠電泳、蔗糖梯度離心或脈沖場(chǎng)電泳。（2）高分子量DNA的準(zhǔn)備外源DNA片段同載體分子的連接主要是依賴(lài)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用。載體的質(zhì)量直接關(guān)系著文庫(kù)中空白載體的比例和文庫(kù)的質(zhì)量，載體的純度越高，獲得陽(yáng)性克隆的概率越高。為減少或避免空白載體的比例，對(duì)載體進(jìn)行脫磷酸處理要徹底，以防止線(xiàn)性載體分子自身的再環(huán)化作用。大片段DNA是否能有效連接在載體上主要取決于插入DNA片段與載體的比例，對(duì)于不同生物采用的比例不同，大多數(shù)BAC文庫(kù)采用1：(5~15)(物質(zhì)的量之比)。（3）外源DNA片段與載體分子的重組包括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔(電轉(zhuǎn)化)等多種不同的方式。

（1）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類(lèi)的原核細(xì)胞和酵母這樣的低等真核細(xì)胞；

（2）顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞。（4）重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1.CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化法

基因原理：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)CaCl2處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。（4）重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞2.電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：通過(guò)高強(qiáng)度的電場(chǎng)作用，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，即形成可逆的瞬時(shí)通道，從而吸收周?chē)橘|(zhì)中的外源分子。（4）重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞3.顯微注射（1）在高倍倒置顯微鏡下，利用顯微操作器，控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置，用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。（2）以細(xì)胞內(nèi)微注射和微灌注技術(shù)為基礎(chǔ)的玻璃針頭的使用，已經(jīng)在越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究領(lǐng)域中成為一項(xiàng)非常普遍的操作方法，比如在體外受精、轉(zhuǎn)基因中等等。（4）重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組子的篩選方法有很多，通常使用lacZ的a-互補(bǔ)所形成的藍(lán)白菌落方法以及抗生素抗性原理篩選陽(yáng)性克隆。（5）陽(yáng)性克隆的挑選評(píng)價(jià)一個(gè)基因組文庫(kù)質(zhì)量高低的標(biāo)準(zhǔn)是文庫(kù)中克隆的數(shù)量、插入片段的大小、細(xì)胞DNA的含量及假陽(yáng)性克隆的含量。一個(gè)基因組文庫(kù)應(yīng)該包含的克隆數(shù)目與該生物基因組的大小和被克隆DNA的長(zhǎng)度有關(guān)?；蚪M越大，所需克隆數(shù)就越多?？寺r(shí)每一個(gè)載體中允許插入外源DNA片段的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，則所需克隆數(shù)越少。2.基因組文庫(kù)的評(píng)價(jià)和鑒定35式中，N為重組體個(gè)數(shù)(基因組文庫(kù)大小)；P為希望獲得的概率(一般為0.99，即99%)；X為文庫(kù)中每個(gè)克隆所含的外源DNA片段的平均長(zhǎng)度；Y為該生物基因組的大小(單倍體基因組長(zhǎng)度)N=ln(1-P)/ln(1-X/Y)從文庫(kù)中隨機(jī)挑選一定量的BAC克隆,提取質(zhì)粒DNA,酶切后,脈沖電泳檢查插入片段的大小。BAC文庫(kù)的鑒定PCR篩選核酸探針雜交篩選基因組文庫(kù)的篩選PCR篩選功能篩選核酸探針雜交篩選基因組文庫(kù)的篩選環(huán)境中微生物具有極大的生物多樣性，但是，99%的微生物不能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)加以培養(yǎng)，微生物可培養(yǎng)性極低。環(huán)境基因組技術(shù)已廣泛應(yīng)用于海洋微生物、土壤微生物、廢水微生物和底泥微生物等各個(gè)方面。利用微生物群落DNA制備的BAC文庫(kù)能夠輕松地檢測(cè)并鑒定所克隆基因片段的功能，甚至能夠得到有關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育的信息。運(yùn)用大片段環(huán)境基因組文庫(kù)配合全基因組shotgun測(cè)序(WGS)技術(shù)來(lái)研究環(huán)境微生物群落具有十分重要的意義。大片段文庫(kù)在環(huán)境基因組中的應(yīng)用41構(gòu)建活性污泥基因組BAC文庫(kù)目的基因序列未知序列已知PCR基因合成基因組文庫(kù)基因文庫(kù)cDNA文庫(kù)生物信息學(xué)分析PCR突變體庫(kù)(1)基因組拼裝(genomeassembly)，是基因組研究的基本步驟，目的是重構(gòu)研究對(duì)象的全基因組序列。由于測(cè)序技術(shù)的讀長(zhǎng)較短，長(zhǎng)度一般是幾十到幾百個(gè)堿基對(duì)，因此需要將測(cè)序得到的堿基片段經(jīng)過(guò)拼接和組裝得到更長(zhǎng)的堿基序列。具體為將測(cè)序得到的堿基片段(reads)拼接成較長(zhǎng)的堿基序列，即Contigs；隨后將Contigs再組裝成更長(zhǎng)的堿基序列，即Scafflods。一、基因組文庫(kù)的構(gòu)建和檢測(cè)第三節(jié)基因組DNA的克隆3.基因組研究的生物信息學(xué)分析44(2)基因預(yù)測(cè)，一般用于預(yù)測(cè)DNA序列中編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的部分，即預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)基因。目前的方法主要有兩類(lèi)：

一類(lèi)是基于序列相似性的預(yù)測(cè)方法，即以mRNA或蛋白質(zhì)序列為線(xiàn)索，在DNA序列中搜尋所對(duì)應(yīng)的片段進(jìn)行基因預(yù)測(cè)；另一類(lèi)是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的預(yù)測(cè)方法，即利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，這種方法不依賴(lài)于已知的蛋白質(zhì)編碼DNA序列。一、基因組文庫(kù)的構(gòu)建和檢測(cè)第三節(jié)基因組DNA的克隆3.基因組研究的生物信息學(xué)分析(3)基因注釋?zhuān)饕ㄟ^(guò)序列比對(duì)來(lái)完成，根據(jù)核酸或者蛋白質(zhì)的相似性來(lái)評(píng)價(jià)序列的同源程度。例如對(duì)SwissProt、NCBInr、KEG或COGs數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)Blast比對(duì)，對(duì)Pfam和TIGRfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行HMMer比對(duì)。從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得與其相似程度最高的序列，通過(guò)這些高相似度序列的功能信息，即數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋的基因(ORF)，便能推測(cè)我們所查詢(xún)序列的可能功能信息。一、基因組文庫(kù)的構(gòu)建和檢測(cè)第三節(jié)基因組DNA的克隆3.基因組研究的生物信息學(xué)分析目的基因序列未知序列已知PCR基因合成基因組文庫(kù)基因文庫(kù)cDNA文庫(kù)生物信息學(xué)分析PCR突變體庫(kù)第四節(jié)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及篩選以mRNA為模板，在體外經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌并繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。一個(gè)高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)包含了生物體某一器官或者組織mRNA的全部或絕大部分遺傳信息。相對(duì)于基因組DNA文庫(kù)來(lái)說(shuō)，cDNA文庫(kù)顯然小得多，因此能夠比較容易地從中篩選獲得細(xì)胞特異表達(dá)的基因。目前，它已成為進(jìn)行生物體功能基因組學(xué)研究常用的基本手段之一。cDNA文庫(kù)①制備mRNA；②第一鏈cDNA合成；③第二鏈cDNA的合成；④雙鏈cDNA的修飾及克??；⑤對(duì)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行鑒定，測(cè)定文庫(kù)的代表性以及重組cDNA片段的序列完整性。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的基本步驟：1.細(xì)胞總RNA的提取cDNA文庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵步驟：提取高質(zhì)量的總RNA。RNA易降解：所用器皿和試劑必需經(jīng)高溫滅菌或DEPC處理一、RNA提取與質(zhì)量鑒定52①所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚和手指以及試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換(使用一次性手套)；②所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2h以上；③凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%焦碳酸二乙酯(

DEPC)水溶液處理，再用去離子水沖凈后高壓滅菌除去DEPC；④所有試劑均要用DEPC處理過(guò)的水配制，DEPC是RNA酶的強(qiáng)變性劑，經(jīng)煮沸DEPC即分解除去，避免殘留物影響mRNA的實(shí)驗(yàn)；RNA酶去除策略：53①所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚和手指以及試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換(使用一次性手套)；②所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2h以上；③凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%焦碳酸二乙酯(

DEPC)水溶液處理，再用去離子水沖凈后高壓滅菌除去DEPC；④所有試劑均要用DEPC處理過(guò)的水配制，DEPC是RNA酶的強(qiáng)變性劑，經(jīng)煮沸DEPC即分解除去，避免殘留物影響mRNA的實(shí)驗(yàn)；⑤在破碎細(xì)胞的同時(shí)用強(qiáng)變性劑(如酚、胍鹽等)使RNA酶失活；⑥在mRNA反應(yīng)中加入RNA酶的抑制劑

Rnasin。RNA酶去除策略：一、RNA提取與質(zhì)量鑒定目前實(shí)驗(yàn)室中提取細(xì)胞總RNA的方法主要有：胍鹽/氯化銫密度梯度超速離心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法等。前一方法常用于大量制備RNA；后一方法用于一般小量制備RNA，因此更為常用。實(shí)驗(yàn)室常用：異硫氰酸胍法（Trizol）Trizol試劑原理：優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、容易操作氯仿抽提、離心分離水相和有機(jī)相RNA抽提專(zhuān)用試劑，由異硫氰酸胍和苯酚組成，可以迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放出細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的RNA收集水相加入異丙醇，沉淀即為RNA下一步mRNA的純化一、RNA提取與質(zhì)量鑒定實(shí)驗(yàn)室常用：異硫氰酸胍法（Trizol）一、RNA提取與質(zhì)量鑒定2.mRNA的分離純化真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5′-端“帽子結(jié)構(gòu)”（m7G）和3′-端的poly(A)“尾巴”。一、RNA提取與質(zhì)量鑒定58

真核基因的結(jié)構(gòu)：5’-GpppGpNpNpNpNpApUpGpNpNpNpUpApGpNpNpNpNpApApApA-3’5’--3‘帽子結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)起始密碼子內(nèi)含子編碼區(qū)外顯子終止密碼子非編碼區(qū)poly(A)尾巴2.mRNA的分離純化真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5′-端“帽子結(jié)構(gòu)”（m7G）和3′-端的poly(A)“尾巴”。絕大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞mRNA的3′-端存在20~30個(gè)腺苷酸成的poly(A)“尾巴”，通常用poly(A)表示，這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，oligo(dT)-纖維素柱色譜分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。一、RNA提取與質(zhì)量鑒定2.mRNA的分離純化常規(guī)方法：oligo（dT）-纖維素柱層析分離法磁珠吸附洗脫法一、RNA提取與質(zhì)量鑒定3.RNA的質(zhì)量鑒定總RNA：紫外分光光度法、電泳法紫外分光光度法：（1）OD260/OD280的比值在1.8~2.0時(shí)，RNA純度較好；OD260/OD280的比值明顯低于1.8，說(shuō)明樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染。

（2）OD260=1時(shí)，相當(dāng)于RNA的濃度為40μg/ml；

電泳法：28S和18S亮度接近2：1，mRNA分布均勻，則認(rèn)為RNA質(zhì)量較好。一、RNA提取與質(zhì)量鑒定3.RNA的質(zhì)量鑒定mRNA：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠法等一、RNA提取與質(zhì)量鑒定1.cDNA第一鏈的合成2.第二鏈cDNA的合成3.雙鏈cDNA的修飾及克隆二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建1.cDNA第一鏈的合成cDNA第一鏈的合成：mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下得到cDNA；常用的反轉(zhuǎn)錄酶：AMV、MLV；常用引物：oligo（dT）、六核苷酸的隨機(jī)引物(dN)6、已知序列引物；注意：反應(yīng)條件的調(diào)整，AMV（42℃）、MLV（37℃）；cDNA長(zhǎng)度應(yīng)為0.7-8kb；二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建傳統(tǒng)cDNA合成技術(shù)1.cDNA第一鏈的合成2.第二鏈cDNA的合成二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建2.第二鏈cDNA的合成第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化；二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建以合成的cDNA單鏈為模板，采用基因特異引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增過(guò)程：PCR擴(kuò)增上游引物與cDNA第一鏈退火，在DNA聚合酶的作用下合成cDNA第二鏈以cDNA第一鏈和第二鏈為模板，用上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR過(guò)程2.第二鏈cDNA的合成第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化；常用方法有3種：自身引導(dǎo)法、置換合成法和引物合成法。二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建Poly（T）引物反轉(zhuǎn)錄酶降解RNADNA聚合酶S1酶去除發(fā)夾發(fā)夾自身引導(dǎo)法：

第一鏈合成過(guò)程中形成cDNA/RNA雜交分子變性，降解RNA；單鏈cDNA分子的3’末端自身環(huán)化，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；以此為引物，在DNA聚合酶作用下合成第二鏈。缺點(diǎn)：S1核酸酶置換合成法

合成cDNA的第一鏈形成mRNA:cDNA雜交鏈；

RNAaseH酶降解mRNA；mRNA鏈上出現(xiàn)切口，產(chǎn)生一系列mRNA引物；大腸桿菌DNA聚合酶合成cDNA的第二鏈。目前合成cDNA常采用該方法1.cDNA第一鏈的合成2.第二鏈cDNA的合成3.雙鏈cDNA的修飾及克隆二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA，必須經(jīng)過(guò)相應(yīng)修飾才能克隆如相應(yīng)載體中。（1）修飾cDNA兩端接頭：人工合成的雙鏈寡核苷酸，含酶切位點(diǎn)。末端轉(zhuǎn)移酶：形成oligo（dG）、oligo（dC）或oligo（dT）、oligo（dA）

3.雙鏈cDNA的修飾及克隆二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建3.雙鏈cDNA的修飾及克隆（2）雙鏈cDNA的克隆cDNA文庫(kù)的載體主要有三種：第一代載體質(zhì)粒，具有易于操作、重組效率高、可直接進(jìn)行功能表達(dá)篩選等優(yōu)點(diǎn)。但是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率低，致使一些低豐度mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA難以包含到所構(gòu)建的文庫(kù)中，因此一般僅在構(gòu)建較高豐度cDNA文庫(kù)和次級(jí)cDNA文庫(kù)時(shí)使用。二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建76第二代載體

噬菌體，目前應(yīng)用最為廣泛，它具備可構(gòu)建低豐度cDNA文庫(kù)、重復(fù)性高、較易保存等優(yōu)點(diǎn)。但是，噬菌體也存在不利于操作，不能定向克隆的缺點(diǎn)，在應(yīng)用中存在一定的難度。噬菌粒型載體

ZAP是第三代載體，兼具前兩代的優(yōu)點(diǎn)，易于按常規(guī)操作方法分析，也可將分泌的單鏈用于構(gòu)建消減文庫(kù)。1.cDNA第一鏈的合成2.第二鏈cDNA的合成3.雙鏈cDNA的修飾及克隆二、cDNA文庫(kù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程示意圖1.文庫(kù)的代表性是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量最重要的指標(biāo)，它是指構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中包含的重組cDNA分子所反映的來(lái)源細(xì)胞中的表達(dá)信息，即mRNA種類(lèi)的完整性。一般可用文庫(kù)的庫(kù)容量，即構(gòu)建的原始cDNA文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)來(lái)衡量文庫(kù)的代表性的好壞。三、cDNA文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)Clack-Carbor公式：N=ln（1-p）/ln（1-1/n）N為cDNA文庫(kù)所包含的克隆數(shù)目；p為文庫(kù)中任何一種mRNA序列信息的概率，通常設(shè)為99%；1/n為某一種低風(fēng)度mRNA（拷貝數(shù)不超過(guò)14%）占總mRNA的比值。三、cDNA文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)1.文庫(kù)的代表性是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量最重要的指標(biāo)，它是指構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中包含的重組cDNA分子所反映的來(lái)源細(xì)胞中的表達(dá)信息，即mRNA種類(lèi)的完整性。一般可用文庫(kù)的庫(kù)容量，即構(gòu)建的原始cDNA文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)來(lái)衡量文庫(kù)的代表性的好壞。重組cDNA片段的序列完整性是指在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA片段的序列完整性。三、cDNA文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)目的基因序列未知序列已知PCR基因合成基因組文庫(kù)基因文庫(kù)cDNA文庫(kù)生物信息學(xué)分析PCR突變體庫(kù)第一節(jié)PCR擴(kuò)增法獲得目的基因本節(jié)要點(diǎn)

RT-PCR法RT-PCR的步驟三種不同引物引導(dǎo)的RT-PCR已知基因N端部分序列RT-PCR其它PCR法反向PCR錨定PCR連接介導(dǎo)的PCR盒式PCRTAIL-PCRRACERT-PCR的步驟反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得RNA模板反轉(zhuǎn)錄：將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈一、RT-PCR法基因特異引物（genespecificprimer，GSP）多聚寡核苷酸引物（oligo(dT)primer）隨機(jī)六核苷酸引物（randomhexamerprimer）三種引物擴(kuò)增特異性

高低將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄的引物：三種反轉(zhuǎn)錄RNA提取反轉(zhuǎn)錄2.三種不同引物引導(dǎo)的RT-PCR一、RT-PCR法

獲得的目的基因的DNA片段不完整，僅知道基因上一小段序列信息時(shí)。適用對(duì)象二、其他PCR法

獲得的目的基因的DNA片段不完整，僅知道基因上一小段序列信息時(shí)。反向PCR錨定PCR連接介導(dǎo)的PCR盒式PCRTAIL-PCRRACE

適用對(duì)象方法二、其他PCR法用于擴(kuò)增已知目的基因序列側(cè)翼的DNA片段

擴(kuò)增對(duì)象操作過(guò)程

酶切

連接環(huán)化

PCR擴(kuò)增

測(cè)序分析

1.反向PCR反向PCR原理示意圖

RS:限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)GSP:基因特異引物也稱(chēng)為單側(cè)特異引物PCR（SSP-PCR），是根據(jù)已知目的基因的一小段序列信息來(lái)快速擴(kuò)增已知序列上游或下游片段的技術(shù)。引物引物1，是根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的基因特異引物，而該已知序列通常是純化蛋白的部分氨基酸序列推測(cè)，部分mRNA序列或已知蛋白比對(duì)獲取的保守序列；引物2，即錨定引物，根據(jù)序列的共同特征設(shè)計(jì)的非特異性引物，非特異性引物所起的作用是在其中一端附著。與錨定引物結(jié)合的序列稱(chēng)為錨定序列。2.錨定PCR2.錨定PCR方法擴(kuò)增目的基因已知序列下游3’端未知序列oligo（dT）作為錨定引物擴(kuò)增目的基因已知序列上游5’端未知序列用DNA末端轉(zhuǎn)移酶，在cDNA3’

末端加上Poly（dA）尾與此Poly（dA）相對(duì)應(yīng)的Poly（dT）作為錨定引物2.錨定PCRPCR具體過(guò)程包括兩輪PCR擴(kuò)增

第一輪：采用不對(duì)稱(chēng)PCR

高濃度的基因特異引物和低濃度的非特異性引物第二輪：以稀釋后的第一輪PCR產(chǎn)物作為模板相同濃度的基因特異引物和非特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增錨定PCR原理示意圖

3.連接介導(dǎo)的PCR應(yīng)用范圍及方法只知道DNA一端的序列又要對(duì)未知的一端進(jìn)行測(cè)序?qū)w內(nèi)甲基化圖譜或DNA印跡進(jìn)行分析在普通PCR過(guò)程中增加了連接的步驟，即通過(guò)連接反應(yīng)加上去一個(gè)公共接頭3.連接介導(dǎo)的PCR引物通過(guò)目的基因的已知序列設(shè)計(jì)的基因特異引物引物1引物2接頭引物連接介導(dǎo)的PCR原理示意圖

4.盒式PCR方法在普通PCR過(guò)程中加入了一個(gè)Cassette（盒）人工合成的帶有限制性?xún)?nèi)切酶的粘性末端的雙鏈DNA分子4.盒式PCRCassette在設(shè)計(jì)時(shí)其5′末端沒(méi)有磷酸基團(tuán)目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的連接部位形成缺口在第一次PCR的第一個(gè)循環(huán)，從Cassette引物CP1開(kāi)始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，限制了引物CP1和引物CP1同一引物之間的擴(kuò)增，減少了非特異性PCR擴(kuò)增特點(diǎn)盒式PCR原理示意圖

CP:Cassette引物GSP:基因特異引物（正義引物）

AGSP:基因特異引物（反義引物）1)GenomewalkingFig.3-8OrganizationofthegeneclusterobtainedbygenomewalkingfromthereportedsequenceinplasmidpRA4000inP.putidaNCIMB9866ThearrowsaboveindicatethesizeandthedirectionofeachORF.Thearrowsbelowindicatethecontigsacquiredfromthreegenomicwalking.pchA

encodesPchA.pchCandpchFencodethecytochromeandflavoproteinsubunitsofPchCF,respectively.pchXencodesaproteinofunknownfunction.OtheropenreadingframeswereannotatedwithaguidebyBLASTresults.pcaHandpcaG:protocatechuate-3,4-dioxygenase;pcaB:3-carboxy-cis,cis-muconatecycloisomerase;pcaC:4-carboxymuconolactonedecarboxylase;tnpA:transposase;tnpR:resolvasePutativestructuralgenesrelatedtoprotocatechuateorthocleavagepathwayinboth2,4-xylenolandp-cresolcatabolismwerefound.Nogeneandenzymeresponsiblefortheoxidationofortho-methylgroupof2,4-xylenolandthedecarboxylationof4-hydroxyisophthalatein2,4-xylenolcatabolismwerefound.FindOtherGenesResponsiblefor2,4-XylenolCatabolismTable3-4Explorethepotentialgenesrelatedto2,4-xylenolcatabolisminthedraftgenomeofstrain9866andidentifythefunctionsoftheirencodingproteinsbybiotransformationNogeneandenzymeresponsiblefortheoxidationofortho-methylgroupof2,4-xylenolandthedecarboxylationof4-hydroxyisophthalatein2,4-xylenolcatabolismwerefoundinthedraftgenomeofstrain9866.

2)WholegenomesequenceFindOtherGenesResponsiblefor2,4-XylenolCatabolismTAIL-PCRTAIL-PCR，ThermalAsymmetricInterlacedPolymeraseChainReaction，即交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR，是一種染色體步移技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)3個(gè)嵌套的特異性引物分別和簡(jiǎn)并引物組合進(jìn)行連續(xù)的PCR循環(huán)，利用不同的退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段，所獲得的片段可以直接用做探針標(biāo)記和測(cè)序模板。5.RACE5’端之間的未知序列5’RACE通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增，得到基因轉(zhuǎn)錄本的未知序列，從而獲得mRNA完整序列的方法。過(guò)程和分類(lèi)以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈用PCR擴(kuò)增出cDNA內(nèi)某一已知序列位點(diǎn)到其末端3’端之間的未知序列3’RACErapid-amplificationofcDNAends5.RACE錨定PCR被用于RACE技術(shù)，根據(jù)錨定序列引入方式的不同，RACE分為經(jīng)典RACE和新RACE

經(jīng)典RACE

：以錨定序列作為引物，3’RACE中在反轉(zhuǎn)錄時(shí)引入第一鏈cDNA，5’RACE中在合成第二鏈時(shí)引入第二鏈cDNA新RACE

：錨定序列在反轉(zhuǎn)錄以前以寡聚核苷酸RNA的形式連入mRNA中經(jīng)典3’RACE操作步驟以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄引物合成3’端cDNA第一鏈，在5’端引入了OP和IP序列

以基因特異引物GSP1和外側(cè)引物OP進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增

以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以基因特異引物GSP2和內(nèi)側(cè)引物IP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序或克隆于適當(dāng)載體進(jìn)行序列分析

即錨定引物TTT(T)n-IP-OP，含oligo（dT）序列、外側(cè)引物區(qū)OP和內(nèi)側(cè)引物區(qū)IP經(jīng)典3’RACE原理示意圖TTT(T)n-IP-OP:錨定引物IP:內(nèi)側(cè)引物區(qū)OP:外側(cè)引物區(qū)GSP:基因特異引物經(jīng)典5’RACE操作步驟以基因特異引物GSP1作為反轉(zhuǎn)錄引物產(chǎn)生cDNA第一鏈在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在cDNA3’末端加上Poly（dC）（或Poly（dA））尾

利用錨定引物（5’OP-IP-oligo（dG））（或5’OP-P-oligo（dT

））和基因特異引物GSP1進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增

以第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，以基因特異引物GSP2和內(nèi)側(cè)引物IP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增

經(jīng)典5’RACE原理示意圖新型5’RACE操作步驟CIAP處理總RNA,使rRNA、tRNA或5’端不完整無(wú)帽的mRNA去磷酸化脫掉5’磷酸基團(tuán)

TAP處理全長(zhǎng)的mRNA，去掉其帽子結(jié)構(gòu)，保留5’端的一個(gè)磷酸基團(tuán)

設(shè)計(jì)錨定序列，具OP和IP區(qū)，用T4RNA連接酶，將具有錨定序列的一段短RNA寡核苷酸與去掉帽子結(jié)構(gòu)的mRNA進(jìn)行連接設(shè)計(jì)兩條引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外側(cè)，以第三步中形成的雜合體為模板，利用引物GSP1為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈

用GSP1和OP，GSP2和IP進(jìn)行巢式PCR新型5’RACE原理示意圖CIAP:牛小腸堿性磷酸酶

TAP:煙草酸性焦磷酸酶

OP:外側(cè)引物區(qū)IP:內(nèi)測(cè)引物區(qū)GSP:基因特異引物大片段DNA是否能有效連接在載體上主要取決于插入DNA片段與載體的比例,對(duì)于不同生物采用的比例不同大多數(shù)BAC文庫(kù)采用1∶5-15(摩爾比)目標(biāo)DNA和載體濃度的確定目的基因序列未知序列已知PCR基因合成基因組文庫(kù)基因文庫(kù)cDNA文庫(kù)生物信息學(xué)分析PCR突變體庫(kù)突變體庫(kù)構(gòu)建及功能篩選第七節(jié)轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（一）受體細(xì)胞（receptercell）：就是能夠攝取外源DNA并能夠使其穩(wěn)定存在的細(xì)胞。選擇原則：（1）細(xì)胞要比較安全，無(wú)致病性或致病缺陷型，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境生物污染。（2）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞要方便。（3）重組DNA分子要能夠在該受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在。（4）重組DNA分子的篩選要方便。（5）遺傳穩(wěn)定性要高，利于擴(kuò)大培養(yǎng)或長(zhǎng)期培養(yǎng)。（6）選擇蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，以利于穩(wěn)定大量收集目的蛋白產(chǎn)物。一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（二）重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞

常用方法：轉(zhuǎn)化，電穿孔，接合，轉(zhuǎn)導(dǎo)。1.Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化法:基因原理：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)CaCl2處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（二）重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞常用方法：轉(zhuǎn)化，電穿孔，接合，轉(zhuǎn)導(dǎo)。2.電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：通過(guò)高強(qiáng)度的電場(chǎng)作用，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，即形成可逆的瞬時(shí)通道，從而吸收周?chē)橘|(zhì)中的外源分子。一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞3.接合轉(zhuǎn)化法基本原理：通過(guò)供體細(xì)胞同受體細(xì)胞間的直接接觸而傳遞外源DNA的方法。（二）重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞常用方法：轉(zhuǎn)化，電穿孔，接合，轉(zhuǎn)導(dǎo)。一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞4.λ噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)導(dǎo)是噬菌體介導(dǎo)的一種DNA或RNA轉(zhuǎn)移過(guò)程。λDNA載體能夠承載較大的外源DNA片段，可以達(dá)到48~51kb。（二）重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞常用方法：轉(zhuǎn)化，電穿孔，接合，轉(zhuǎn)導(dǎo)。（一）依據(jù)載體的選擇性標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選1.抗藥性篩選法：重組DNA載體上攜帶有受體細(xì)胞敏感的抗生素抗性基因時(shí)，通?？梢匀∮棉D(zhuǎn)化體系涂布含該抗生素的選擇培養(yǎng)平板的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的第一輪篩選。

二、重組子的篩選與鑒定常用的一種顯色篩選法是藍(lán)白斑篩選法，利用的是lacZ基因的α-互補(bǔ)原理，由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的lacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，破壞了lacZ的N端片段，α-互補(bǔ)也遭到破壞，因此使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。

2.顯色篩選法二、重組子的篩選與鑒定突變型受體細(xì)胞上缺乏合成某種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而載體分子上攜帶了這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物合成基因，利用缺少該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成培養(yǎng)基進(jìn)行涂布培養(yǎng)時(shí)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子能夠長(zhǎng)出菌落。3.營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法二、重組子的篩選與鑒定λ噬菌體在感染細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)平板上會(huì)產(chǎn)生噬菌斑，利用這種特性，λDNA重組載體在轉(zhuǎn)染受體菌時(shí)，能夠形成噬菌斑則為轉(zhuǎn)化子，非轉(zhuǎn)化子正常生長(zhǎng)不會(huì)形成噬菌斑。4.噬菌斑篩選法二、重組子的篩選與鑒定（二）菌落原位雜交法主要原理是利用和目的DNA某一序列堿基互補(bǔ)配對(duì)設(shè)計(jì)DNA或RNA探針，在適宜的溫度和離子體系中，探針序列與目的DNA兩條核酸特異性地雜交，可以通過(guò)放射性同位素或熒光基團(tuán)定位。二、重組子的篩選與鑒定（一）

Sanger雙脫氧鏈終止法試劑包括：引物，模板，DNA聚合酶，ddNTP，dNTP等。

基本原理:在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從引物3'末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)體系中分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，然后將這四組寡核苷酸分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶的分布即可讀出待測(cè)DNA鏈的序列。

三、DNA序列測(cè)定（二）Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法基本原理:一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在4組互相獨(dú)立的的化學(xué)反應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某一種或某一類(lèi)堿基。因此生成4組放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。三、DNA序列測(cè)定三、DNA序列測(cè)定（三）大片段DNA的測(cè)序方案（1）隨機(jī)法（或鳥(niǎo)槍測(cè)序法）（2）定向法（3）限制酶切-亞克隆測(cè)序法三、DNA序列測(cè)定（四）大規(guī)模DNA測(cè)序的發(fā)展趨勢(shì)大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)（massivelyparallelDNAsequencingplatform）已經(jīng)發(fā)展為主流的測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；闹匾獥l件是自動(dòng)化和機(jī)械化。感謝聆聽(tīng)第六章原核細(xì)胞基因工程第六章原核細(xì)胞基因工程在基因工程中，目的基因的異源表達(dá)主要包括三個(gè)要素目的蛋白的DNA編碼序列、表達(dá)載體、表達(dá)宿主(受體細(xì)胞或受體菌)。目的基因表達(dá)要素目的基因載體宿主需要表達(dá)的DNA序列運(yùn)送外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞表達(dá)目的基因的細(xì)胞（原核或真核）在基因工程中，目的基因的異源表達(dá)主要包括三個(gè)要素目的蛋白的DNA編碼序列、表達(dá)載體、表達(dá)宿主(受體細(xì)胞或受體菌)。其中，利用原核細(xì)胞作為表達(dá)宿主進(jìn)行目的基因重組表達(dá)被稱(chēng)為原核表達(dá)，相應(yīng)的基因工程技術(shù)被稱(chēng)為原核細(xì)胞基因工程。①原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)生物，具有生長(zhǎng)快、代謝易于控制的特點(diǎn)，可通過(guò)發(fā)酵迅速獲得大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。②原核生物只有一種RNA聚合酶(真核細(xì)胞有三種)，識(shí)別原核基因的啟動(dòng)子，催化所有RNA的合成。③因?yàn)樵松餆o(wú)核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，二者也是連續(xù)進(jìn)行的；而且在翻譯過(guò)程中，mRNA可與多個(gè)核糖體結(jié)合形成多核糖體(polyribosome)，即在一條mRNA鏈上可以有多個(gè)核糖體同時(shí)進(jìn)行合成反應(yīng)，大大提高了翻譯效率。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)。本章內(nèi)容第一節(jié)原核表達(dá)系統(tǒng)的種類(lèi)第二節(jié)原核表達(dá)策略第三節(jié)基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)第四節(jié)原核表達(dá)產(chǎn)物的分離純化第五節(jié)基因工程菌不穩(wěn)定性及對(duì)策第六節(jié)原核表達(dá)應(yīng)用舉例第一節(jié)

原核表達(dá)系統(tǒng)的種類(lèi)一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)主要包括表達(dá)載體和受體菌株。其中，表達(dá)載體是將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并在宿主中實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)的運(yùn)輸工具。原核細(xì)胞表達(dá)載體的主體部分主要來(lái)自于相應(yīng)宿主菌株的內(nèi)源質(zhì)粒，以此為基礎(chǔ)添加與克隆表達(dá)相關(guān)的元件，即構(gòu)成完整表達(dá)載體。原核表達(dá)載體除具有克隆載體所具有的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性選擇標(biāo)記等以外，還帶有原核細(xì)胞所需要的表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止子和SD序列，有時(shí)還包括融合標(biāo)簽的DNA編碼序列等。優(yōu)點(diǎn)：它的遺傳背景清晰，基因工程操作手段完善；代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚；已有大量可供選用的大腸桿菌表達(dá)載體；它的培養(yǎng)成本低廉，生長(zhǎng)繁殖迅速，

抗污染能力強(qiáng)，適合于大規(guī)模培養(yǎng)；外源基因產(chǎn)物的表達(dá)量高，目的蛋白可以占細(xì)菌總蛋白的30%以上，因此是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺點(diǎn)：目的蛋白常形成包涵體，導(dǎo)致后期純化過(guò)程繁瑣，應(yīng)用成本高；由于原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，所以在表達(dá)某些真核基因時(shí)，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物無(wú)法正確折疊或進(jìn)行糖基化、磷酸化修飾，致使產(chǎn)物的生物活性相對(duì)較低。大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定；大腸桿菌細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，痕量的內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用的外源基因表達(dá)的載體有：pET系統(tǒng)、pBV等。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。1.BL21(DE3)該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。2.BL21(DE3)pLysS該菌株含有質(zhì)粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾目的蛋白的表達(dá)。該菌適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是經(jīng)過(guò)修飾，專(zhuān)用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是經(jīng)過(guò)修飾，專(zhuān)用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。4.JM109

該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性。芽孢桿菌為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白質(zhì)到體外，為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種，能形成芽孢，而子囊中只有一個(gè)芽孢。除個(gè)別種如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)外，其他芽孢桿菌對(duì)人畜無(wú)毒。二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①芽孢桿菌是非致病微生物，比較安全；②培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于控制；③生長(zhǎng)迅速，周期短；④表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中；⑤多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性；⑥某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，且利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺點(diǎn)：野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

因此，在構(gòu)建芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)宿主菌時(shí)需要將蛋白酶基因進(jìn)行突變或敲除，使其降低活性甚至失活。遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備。二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)二.芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用：適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌。目前應(yīng)用較多的芽孢桿菌宿主菌有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢杄菌、淀粉芽孢杄菌、巨大芽孢桿菌、球形芽孢杄菌、短芽孢杄菌、嗜熱脂肪芽孢杄菌、耐堿的芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等。

其中，枯草芽孢桿菌(又稱(chēng)枯草桿菌，Bacillussubtilis)表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的，枯草芽孢桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，人們對(duì)其遺傳背景和生理學(xué)特性的了解僅次于大腸桿菌。鏈霉菌是一類(lèi)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中，能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①鏈霉菌為非致病菌，使用比較安全；②不產(chǎn)生內(nèi)毒素；③表達(dá)產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外；④可進(jìn)行高密度培養(yǎng)；⑤具有豐富的次生代謝途徑和初級(jí)、次生代謝調(diào)控系統(tǒng)；⑥鏈霉菌進(jìn)行工業(yè)規(guī)模化發(fā)酵的技術(shù)成熟。缺點(diǎn)：遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用：鏈霉菌受體系統(tǒng)中常用的宿主菌有變鉛青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌。天藍(lán)色鏈霉菌有很強(qiáng)的修飾系統(tǒng)，因此在實(shí)際應(yīng)用中均以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)。變鉛青鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌的卡那霉素抗性基因(Kan)、牛生長(zhǎng)激素基因、人白細(xì)胞介素2基因、人乙肝表面抗原(HBsAg)基因、人類(lèi)干擾素(IFN-a2、IFN-a1)基因、人類(lèi)腫瘤壞死因子(TNF)基因等。三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)三.鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)1952年，美國(guó)微生物學(xué)家賽爾曼·A·瓦克斯曼（SelmanA.Waksman）因“發(fā)現(xiàn)鏈霉素——第一個(gè)有效對(duì)抗結(jié)核病的抗生素”獲得了當(dāng)年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。藍(lán)藻又稱(chēng)藍(lán)細(xì)菌，是一類(lèi)能夠進(jìn)行植物型放氧光合作用的原核生物，有大約150個(gè)屬，2000余種。藍(lán)藻具有獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，多年來(lái)一直被廣泛應(yīng)用于光合作用、固氮作用和葉綠體起源等生物學(xué)問(wèn)題的研究中。近年來(lái)，隨著藍(lán)藻分子生物學(xué)研究的深入，藍(lán)藻也開(kāi)始被作為表達(dá)外源目的基因的受體系統(tǒng)。四.藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①藍(lán)藻遺傳背景簡(jiǎn)單，便于基因操作和外源DNA的檢測(cè)；②藍(lán)藻是革蘭陰性菌，細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化；③光合自養(yǎng)型生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、CO2、無(wú)機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿(mǎn)足生長(zhǎng)需要，生產(chǎn)成本低；④多數(shù)藍(lán)藻有內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了良好的條件；⑤藍(lán)藻在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期均處于感受態(tài)，便于外源基因的轉(zhuǎn)化；四.藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：⑥多數(shù)藍(lán)藻無(wú)毒，且富含蛋白質(zhì)，早已用作食品或保健品，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，將一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無(wú)毒藍(lán)藻，可達(dá)到錦上添花的效果。四.藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用第二節(jié)

原核細(xì)胞表達(dá)策略①目的基因DNA片段的制備。目的基因可以從基因組中進(jìn)行擴(kuò)增，也可以通過(guò)人工合成的方法獲得。值得注意的是，原核細(xì)胞中缺乏真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，因此目的基因不能用真核生物的基因組DNA，而應(yīng)該用cDNA。②目的基因與表達(dá)載體的連接。表達(dá)載體中，在啟動(dòng)子區(qū)的下游設(shè)計(jì)有多克隆位點(diǎn)，目的基因的DNA片段通過(guò)這些位點(diǎn)插入到啟動(dòng)子的下游，受到相應(yīng)啟動(dòng)子的調(diào)控。③將重組載體導(dǎo)入到宿主菌中，從而獲得相應(yīng)的基因工程菌株。一般的轉(zhuǎn)化方法包括化學(xué)法、電轉(zhuǎn)化等。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)主要包括以下步驟外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)主要包括以下步驟④對(duì)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在生長(zhǎng)量達(dá)到一定水平后誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，根據(jù)啟動(dòng)子的類(lèi)型，分為組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)。⑤檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量及活性，然后進(jìn)行分離純化。一.融合型表達(dá)將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因的閱讀框，這樣形成的蛋白質(zhì)稱(chēng)為融合蛋白。外源蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)時(shí)能以較高的效率進(jìn)行，因?yàn)槭荏w菌自身蛋白基因的SD序列和堿基組成等有利于基因的表達(dá)。常見(jiàn)的融合蛋白表達(dá)載體包括pRSET、pGEX系列等。一.融合型表達(dá)表達(dá)融合型蛋白時(shí)，為了得到正確的真核蛋白，在插入真核基因時(shí)，應(yīng)非常注意其閱讀框架，確保融合的各個(gè)DNA片段的閱讀框架一致，只有這樣，在翻譯時(shí)才不至于產(chǎn)生移碼突變。以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高，尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離，利用受體蛋白建立相應(yīng)抗體、配體、底物親和層析系統(tǒng)，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達(dá)率高，與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件。目的蛋白溶解性好，由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收，融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。一.融合型表達(dá)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因要能高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化。外源基因應(yīng)在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件。兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架。一.融合型表達(dá)用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫親和層析pRIT2T硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構(gòu)象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促進(jìn)分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）維持良好空間構(gòu)象一.融合型表達(dá)目的蛋白的回收：一.融合型表達(dá)融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專(zhuān)一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法和酶促裂解法?；瘜W(xué)斷裂法：一.融合型表達(dá)用于蛋白位點(diǎn)專(zhuān)一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr），它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專(zhuān)一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。化學(xué)斷裂法：一.融合型表達(dá)如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。一.融合型表達(dá)蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專(zhuān)一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專(zhuān)一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。

酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CArgCNNC受體蛋白目的蛋白酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)一.融合型表達(dá)

蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來(lái)說(shuō)，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的。酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)一.融合型表達(dá)為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來(lái)的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在A(yíng)rg的C末端。

純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。目的蛋白的回收ATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCXa-1ATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaIXa因子切割位點(diǎn)IleGluGlyArgGlu酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列生物素結(jié)合肽編碼序列SP6T7AproritacMCSPinpointXa啟動(dòng)子受體基因GST接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）谷胱甘肽酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)二.非融合型表達(dá)不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱(chēng)為非融合蛋白。非融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它具有非常近似于真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。二.非融合型表達(dá)非融合蛋白的最大缺點(diǎn)是容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。為了在原核細(xì)胞中表達(dá)出非融合蛋白，可將帶有起始密碼ATG的真核基因插到原核啟動(dòng)子與SD序列的下游，組成一個(gè)雜合的核糖體結(jié)合區(qū)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯，得到非融合蛋白。不易分離純化。三.分泌型表達(dá)大腸桿菌中某些蛋白質(zhì)屬于分泌型蛋白質(zhì)，可以被分泌到細(xì)胞膜外的間質(zhì)中，這是由于在這些蛋白質(zhì)的N端存在著一段稱(chēng)為信號(hào)肽(signalpeptide)的多肽。在信號(hào)肽的幫助下，蛋白質(zhì)可以跨過(guò)細(xì)胞膜而分泌到胞外。蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感。三.分泌型表達(dá)大腸桿菌中某些蛋白質(zhì)屬于分泌型蛋白質(zhì)，可以被分泌到細(xì)胞膜外的間質(zhì)中，這是由于在這些蛋白質(zhì)的N端存在著一段稱(chēng)為信號(hào)肽(signalpeptide)的多肽。在信號(hào)肽的幫助下，蛋白質(zhì)可以跨過(guò)細(xì)胞膜而分泌到胞外。因此，將編碼信號(hào)肽的DNA序列插入到載體的啟動(dòng)子與目的基因之間，就可使目的基因編碼的蛋白質(zhì)分泌到胞外，減少了細(xì)菌蛋白酶的破壞，同時(shí)為表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等提供了極大的方便。三.分泌型表達(dá)常用的分泌型表達(dá)載體包括pINⅢ、plN-ompA等系列。三.分泌型表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化了發(fā)酵后處理的純化工藝；減少了外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶降解的概率；通過(guò)對(duì)分泌表達(dá)的設(shè)計(jì)有利于形成正確的空間構(gòu)象，獲得有較好生物學(xué)活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。三.分泌型表達(dá)缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。四.多拷貝表達(dá)外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平與目的基因的拷貝數(shù)相關(guān)。研究表明，當(dāng)表達(dá)載體上外源基因的拷貝數(shù)增加時(shí)，可將外源蛋白的表達(dá)量相應(yīng)提高。表達(dá)載體上可表達(dá)的基因包括外源基因和選擇標(biāo)記基因等，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒表達(dá)載體的拷貝數(shù)增加時(shí)，用于合成目的蛋白之外的其他蛋白質(zhì)的量也相應(yīng)增加，而過(guò)多地表達(dá)非目的基因消耗大量能量，影響菌株的生長(zhǎng)代謝。因而在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，可以考慮將多個(gè)外源蛋白基因串聯(lián)在一起，克隆在嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒載體上。四.多拷貝表達(dá)以這種策略表達(dá)外源蛋白時(shí)，雖然宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)減少，但外源基因在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA的拷貝數(shù)并不減少。這種方法對(duì)分子量較小的外源蛋白更為有效。四.多拷貝表達(dá)外源基因多分子線(xiàn)性重組的方式通常有三種：一是多表達(dá)單元的重組，即每個(gè)表達(dá)單元都含有獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串聯(lián)翻譯的表達(dá)單元，表達(dá)單元之間的連接方向與表達(dá)效率無(wú)關(guān)。表達(dá)的外源蛋白不須經(jīng)過(guò)裂解處理。這種方式適合于表達(dá)分子量較大的蛋白質(zhì)。典型的編碼蛋白質(zhì)的原核基因結(jié)構(gòu)示意圖四.多拷貝表達(dá)外源基因多分子線(xiàn)性重組的方式通常有三種：一是多表達(dá)單元的重組，即每個(gè)表達(dá)單元都含有獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串聯(lián)翻譯的表達(dá)單元，表達(dá)單元之間的連接方向與表達(dá)效率無(wú)關(guān)。表達(dá)的外源蛋白不須經(jīng)過(guò)裂解處理。這種方式適合于表達(dá)分子量較大的蛋白質(zhì)。二是多順?lè)醋又亟M，即多拷貝外源基因有各自的SD序列、翻譯起始和終止信號(hào)，但這些基因的轉(zhuǎn)錄使用共同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子，表達(dá)的外源蛋白分子仍是相互獨(dú)立的，這種方式對(duì)表達(dá)中等大小分子量的外源蛋白比較合適。四.多拷貝表達(dá)外源基因多分子線(xiàn)性重組的方式通常有三種：三是多編碼序列重組，即將多個(gè)外源基因串聯(lián)在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和翻譯起始與終止密碼子，在各自編碼序列的連接處引入蛋白酶酶切位點(diǎn)或可被化學(xué)斷裂的位點(diǎn)，這種方式適合表達(dá)外源小分子量蛋白質(zhì)或多肽。五.整合型表達(dá)將一種重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的代謝會(huì)發(fā)生較大改變，同時(shí)由于細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，經(jīng)若干次傳代后宿主細(xì)胞內(nèi)的重組質(zhì)粒會(huì)發(fā)生丟失。因此，一種理想的選擇是將要表達(dá)的外源基因整合到宿主菌的染色體的特定位置上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。五.整合型表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：目的基因表達(dá)穩(wěn)定整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義。缺點(diǎn)：目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償。在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類(lèi)：DNA體內(nèi)重組的基本原理（1）轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型（2）同源序列依賴(lài)型轉(zhuǎn)位因子是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類(lèi)無(wú)復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子，例如：轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族DNA體內(nèi)重組的基本原理噬菌體

G片段（G-Fragment）真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty）原核細(xì)菌 插入順序（IS）高等植物

可移動(dòng)因子（Ac、Ds）高等動(dòng)物 跳躍基因（mobilgene）轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)IS（1kb）Ty（5kb）Tn（2-20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識(shí)別位點(diǎn)阻遏基因IRIRIRIRISISDNA體內(nèi)重組的基本原理在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細(xì)菌種類(lèi)、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。一般地說(shuō)，距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)。（2）同源序列依賴(lài)型的體內(nèi)重組：基本形式DNA體內(nèi)重組的基本原理（2）同源序列依賴(lài)型：同源交換DNA體內(nèi)重組的基本原理染色體DNA同源區(qū)域標(biāo)記基因ori目的基因整合位點(diǎn)（2）同源序列依賴(lài)型：同源交換DNA體內(nèi)重組的基本原理ori同源區(qū)域交換區(qū)域染色體DNA目的基因標(biāo)記基因ori+六.提高表達(dá)效率的方法1.啟動(dòng)子的選擇2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)3.選擇強(qiáng)終止子4.提高表達(dá)載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對(duì)密碼子的偏好性1.啟動(dòng)子的選擇原核基因的表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平，以操縱子為單位，因此啟動(dòng)子的正確選擇是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白高表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。原核生物的啟動(dòng)子一般由四部分構(gòu)成：①轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；②Pribnowbox(也稱(chēng)-10區(qū))；③Sextama框(也稱(chēng)-35區(qū))；④間隔區(qū)。①作用要強(qiáng)，待表達(dá)的基因產(chǎn)物要占有或超過(guò)菌體總蛋白的10%~30%；②必須表現(xiàn)最低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，最好選用高密度培養(yǎng)細(xì)胞和表現(xiàn)最低基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的可誘導(dǎo)或非抑制啟動(dòng)子，以減少合成的外源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用或?qū)ζ渖L(zhǎng)的限制作用；③啟動(dòng)子具有簡(jiǎn)便和廉價(jià)