WB-Protocol 免疫印跡實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)(精華)

WB-protocol配液：1mol/LTris-HCl：12.114gTris-base，加水至100ml，PH6.81.5mol/LTris-HCl：18.7gTris-base，加水至100ml，PH8.810％SDS：5g電泳級(jí)SDS加水定容至50ml，可加熱至68℃助溶Acrylamide<!>29g30%丙烯酰胺methylenediacrylamide<!>1g加水至100ml溶解，避光4℃保存{將29g丙烯酰胺和1gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Pall濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。}10%AP：Ammoniumpersulfate10%(w/v)-20℃保存一個(gè)星期，一般一次配1ml。Glycine144g10×runningbuffer（1L）Tris-base30gSDS10g加水至1L1×runningbuffer（1L）:直接從10×runningbuffer加水稀釋Glycine145g10×transferbuffer（1L）Tris-base29g加水至1L10×transferbuffer100ml1×transferbuffer（1L）methanol200ml加水至1LTris-base24.2g10×TBS（1L）Nacl80g36%Hcl約14mlpH調(diào)至7.6，加水至1L10×TBS100ml1×TBST（1L）Tween-200.5ml（即0.05%，臨用時(shí)加入）加水至1L封閉液(5%)：也為抗體稀釋液，5g脫脂奶粉溶于100ml1×TBST配制Glycerine2ml（20%）20×loadingbuffer(變性劑)bromophenolblue0.03%（適量）DTT0.3ml（3%）<!>4×uppertris7.7ml4×uppertris：Tris-base12.12g（0.5M）、10%SDS8ml，PH6.8，總計(jì)200ml1×samplebuffer：50mmol/LTris-HCl(PH6.8),20g/LSDS(電泳級(jí))，10%GlycerolPonceauS麗春紅:0.1%,0.1g溶于5ml冰醋酸;H2O至100ml，4℃保存。（可重復(fù)使用）DTT組份濃度：1MDTT

配制量：10mL

配制方法：

1.稱取1.545gDTT，加入到15mL塑料離心管內(nèi)。

2.加10mL的0.01M的NaOAc（醋酸鈉）（pH5.2），溶解后使用0.22μm濾器過濾除菌。

3.適量分成小份后，-20℃保存。

3M醋酸鈉（NaOAc）（100ml）

1．稱取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200ml燒杯中，加入約40ml的去離子水后攪拌溶解。

2．加冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.2。

3．定容至100ml，高壓滅菌后室溫保存。

（參照《分子克隆》二版P884）

0.01MNaOAc(pH5.2)參照此配方配制。實(shí)驗(yàn)步驟一、蛋白樣品制備培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)樣品的制備（還沒做過組織的，以后補(bǔ)充）a、收集：細(xì)胞培養(yǎng)至皿（100cm）上長(zhǎng)滿時(shí)，經(jīng)PBS漂洗3次，加入1ml的1×samplebuffer,細(xì)胞刮收集，冰上操作，轉(zhuǎn)移至離心管中，置-20℃保存。b、裂解：超聲（超聲5s間歇10s，功率100至120w）或注射器反復(fù)抽吸破碎，至細(xì)胞裂解液澄清不粘稠為止。置于冷凍離心機(jī)4℃25000g離心15min取上清；BCA（標(biāo)準(zhǔn)曲線）蛋白定量：準(zhǔn)備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋（20–2,000μg/ml）VialH2O體積（ul）BSA體積（ul）BSA濃度A0100μlofStock2,000μg/mlB50150μlofStock1,500μg/mlC100100μlofStock1,000μg/mlD5050μlofvialBdilution750μg/mlE100100μlofvialCdilution500μg/mlF100100μlofvialEdilution250μg/mlG100100μlofvialFdilution125μg/mlH10025μlofvialGdilution25μg/mlI10000μg/ml準(zhǔn)備工作液WorkingReagent(A:B=50:1)所需體積=(#standards+#unknowns)×(#replicates)×(volumeofWRpersample)c．操作步驟：1.吸取25ul標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品到96孔板（復(fù)孔1個(gè)），sample/WR=1:8（如果樣品量太少多，改為上10ulsample/WR=1:20，檢測(cè)范圍125-2,000μg/ml）2.加200ul的WR，搖床混勻1min；3．合上蓋子在37℃孵育30min；4．冷卻至室溫，約20-30min5.在紫外分光光度計(jì)562nm下讀數(shù)6.畫標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出待測(cè)樣品濃度蛋白變性：在提取的蛋白中按每100ul加5ul20×loadingbuffer混勻后，置98℃水浴鍋中煮沸10min使蛋白變性。若離心5min可以避免拖尾現(xiàn)象。二、制膠1、分離膠：一般來說，蛋白分子量越小需要膠的濃度越大，SDS分離膠濃度最佳分離范圍（6%膠50-150Kd；8%膠30-90kD；10%膠20-80kD；12%膠12-60kD；15%膠10-40kD）按比例配制分離膠，輕緩搖動(dòng)溶液8~9次，使激活劑混合均勻，配好后灌膠，然后用超純水封膠。當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)（約30min），就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。濃縮膠：沿玻璃板平緩注入凝膠溶液，然后保持水平插梳（上樣孔不得留有氣泡），靜置30min后保證完全聚合。上樣，依次加入蛋白marker和待分析樣品，加樣時(shí)間盡量短，避免樣品擴(kuò)散和邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量樣品緩沖液。電泳加樣完畢，蓋好電泳槽蓋子并選擇適當(dāng)恒壓，一般濃縮膠80V，20min，分離膠120V，90min，電泳至溴酚藍(lán)跑出凝膠末端處即可停止。（通電時(shí)，檢查有否氣泡產(chǎn)生）四、電轉(zhuǎn)電泳結(jié)束后，取出凝膠，在預(yù)冷電轉(zhuǎn)甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒；1、膜的預(yù)處理：按膠的大小剪下相應(yīng)大小的PVDF膜（在右上角剪一個(gè)缺角，作為轉(zhuǎn)膜時(shí)正面的標(biāo)記，下方標(biāo)注蛋白名稱、日期）；將PVDF膜于甲醇中浸泡3-5min，放置于轉(zhuǎn)膜液中；2、按膠的大小剪切轉(zhuǎn)膜用濾紙，共6張，置于轉(zhuǎn)膜液中浸濕5min；3、將浸透轉(zhuǎn)移液的海綿、濾紙、PVDF膜和膠按下列順序從下至上放置于濕轉(zhuǎn)膜器中。從下至上為：夾子透明邊-海綿－三層濾紙－PVDF膜－膠－三層濾紙－海綿-夾子黑色邊。用玻璃棒輕輕碾壓，擠出可能存在的氣泡；放入轉(zhuǎn)膜器（注意方向，PVDF膜對(duì)正極，膠對(duì)負(fù)極）；4、加入4℃預(yù)冷Transferbuffer，80mA恒流轉(zhuǎn)膜（低溫），分子量50KDa左右的蛋白用120min，20KDa左右的用90min。一般轉(zhuǎn)膜電流200mA之間，時(shí)間30~60min或15~20mA過夜。大片段（>50KD）可選350mA，小片段可選250mA。濾紙最好不要比膜大，防止短路，各層之間無氣泡。槽內(nèi)夾子兩旁放入冰袋。五、膜的封閉進(jìn)行抗體雜交前需對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，防止免疫試劑的非特異性吸附，取1×TBS漂洗3次×5min的轉(zhuǎn)印膜，放入5%脫脂奶粉的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉1h。六、抗體雜交封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的一抗，去除袋內(nèi)所有氣泡，封口，4℃孵育過夜或室溫（22~25℃）搖動(dòng)孵育1h，1×TBST洗膜3次×5min，加入5％脫脂奶稀釋的HRP標(biāo)記二抗（不能加疊氮鈉，因?yàn)閷?duì)過氧化酶有抑制作用）室溫1h，1×TBST洗膜3次×5min。七、檢測(cè)辣根過氧化物酶-ECL法增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，生成不穩(wěn)定的中間代謝物，其衰變時(shí)是在暗室里形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶，并可利用X光感光膠片記錄發(fā)光結(jié)果，這里使用SuperSignalWestPico（Thermo）增強(qiáng)ECL發(fā)光劑，在暗室將雜交后印記膜放入顯色盒中，加上混合好的顯色液，用紙巾吸去多余的顯色液，加蓋一透明玻璃紙并撫平，將印記膜在暗室中使膠片曝光不同時(shí)間，其間沖洗膠片以確定所測(cè)抗原的最佳曝光時(shí)間?；瘜W(xué)顯色，顯影，定影（1）將顯色發(fā)光劑A、B各取1滴（1:1混勻約共1.5ml）滴于PVDF膜上，反應(yīng)2-3min后，用濾紙將PVDF膜邊緣或者邊角多余液體吸干，加蓋一層透明玻璃紙并撫平，保證干的表面與膠片接觸，在暗室中放置膠片，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上暗盒。（2）將顯影液、自來水和定影液分別到入搪瓷盤中；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min；曝光完成后，打開曝光盒，取出X光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，自來水沖洗終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～3min（20～25℃），溫度過低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，自來水中漂洗數(shù)秒，把X光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為1min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。WB試劑品名品牌規(guī)格價(jià)格代理備注甘氨酸amresco500g60博納泰克丙烯酰胺amresco500g70博納泰克甲叉丙烯酰胺amresco100g160博納泰克過硫酸銨amresco25g200博納泰克溴酚藍(lán)amresco10g56.00博納泰克二