藍(lán)莓酒發(fā)酵復(fù)合酶的篩選與應(yīng)用

藍(lán)莓酒發(fā)酵復(fù)合酶的篩選與應(yīng)用

0藍(lán)莓酒是最主要特色的水果藍(lán)莓是薔薇科植物的學(xué)名，屬于薔薇科和藍(lán)莓科。藍(lán)莓果為小漿果,果實(shí)呈藍(lán)色,近圓形,果肉細(xì)膩,種子極小。甜酸適度,且具有香爽宜人的香氣,可鮮食,也可作為食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)的原料。藍(lán)莓單果重0.5~2.5g,最大可達(dá)3.5~5.0g,對從美國引進(jìn)的14個(gè)品種的藍(lán)莓果實(shí)分析,每百克藍(lán)莓鮮果中含蛋白質(zhì)400~700mg、脂肪500~600mg、碳水化合物12.3~15.3mg、維生素A高達(dá)81~100國際單位、維生素E2.7~9.5μg、SOD5.39國際單位,維生素都高于其他水果。微量元素也很高,每克鮮果中鈣220~920μg,磷98~274μg,鎂114~249μg,鋅2.1~4.3μg,鐵7.6~30.0μg,鍺0.8~1.2μg,銅2.0~3.2μg。藍(lán)莓果實(shí)中富含水果中常見的多種營養(yǎng)成分,以及花色素苷、類黃酮等抗氧化劑和細(xì)菌生長抑制劑,屬高氨基酸、高鋅、高鐵、高銅、高維生素的果品,具有良好的營養(yǎng)保健作用,包括增強(qiáng)視力、消除眼睛疲勞、防止腦神經(jīng)老化、抗癌、軟化血管、增強(qiáng)人體免疫等。其營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于蘋果、葡萄、橘子等水果,堪稱“世界水果之王”,是近幾年世界發(fā)展最為迅速的集營養(yǎng)與保健于一身的第三代漿果,風(fēng)靡當(dāng)今歐美日等國家和地區(qū)。藍(lán)莓果實(shí)不僅營養(yǎng)價(jià)值高,含有大量對人類健康有益的物質(zhì),包括抗氧化物(VA、VC、VE),靴酸、抗菌成分和豐富的食用纖維等。國際上鮮果的零售價(jià)很高,美國最低零售價(jià)在3美元/磅左右,日本高達(dá)40~50美元/kg。鮮食藍(lán)莓通常以125g為單位包裝銷售,采收后的包裝、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、上市和貨架過程均需在0℃左右條件下進(jìn)行,保鮮期約3個(gè)月。我國生產(chǎn)的藍(lán)莓鮮果的出口價(jià)在5美元/kg以上,未能及時(shí)作為鮮果銷售的藍(lán)莓和殘次果,可以加工果汁和釀造營養(yǎng)豐富的藍(lán)莓酒等。我國發(fā)展藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)潛力巨大,在黑龍江的伊春地區(qū),加格達(dá)奇地區(qū),大興安嶺地區(qū),都盛產(chǎn)野生藍(lán)莓。近幾年我國種植發(fā)展較快,在貴州、江蘇、吉林、遼寧都有大面積種植,藍(lán)莓果國內(nèi)年產(chǎn)量可以達(dá)到5000噸以上,僅丹東市藍(lán)莓種植面積已達(dá)近萬畝。為我們開發(fā)藍(lán)莓產(chǎn)品的深加工提供了原料保證。近幾年來,我們從復(fù)合生物酶制劑,分離,篩選,鑒定酵母菌開始,作了大量的試驗(yàn)工作,研究釀造藍(lán)莓酒的最佳工藝條件,取得了突破性進(jìn)展。本文重點(diǎn)介紹組合酶法快速釀造藍(lán)莓酒新工藝的生產(chǎn)方法,現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下:1材料和方法1.1材料表面1.1.1酶劑1.1.2藍(lán)莓果實(shí)：由遼寧省龍鑫藍(lán)莓飲料有限公司提供1.1.3母菌種類從不同品種藍(lán)莓果和黑加侖子果的果實(shí),以及不同地區(qū)藍(lán)莓果和黑加侖子果的果園中篩選、分離、純化、鑒定得到。1.2測試方法1.2.1組合酶正交試驗(yàn)根據(jù)生物酶法釀造黑莓酒的研究,分解藍(lán)莓果的生物酶我們初步確定了使用果膠酶,纖維素酶和半纖維素酶三種酶,用正交表L9(34)設(shè)計(jì)組合酶含量及組合酶用量,作為四因素,每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。用上述4因素,3水平正交表設(shè)計(jì)分解藍(lán)莓最佳酶制劑組合的驗(yàn)方案如下:1.2.2通過分離和測定細(xì)菌性能1.2.2.麥芽汁常用菌落的分離和純化從不同品種的藍(lán)莓果和黑加侖子果實(shí),以及不同地區(qū)的藍(lán)莓果和黑加侖子果園土,用12°BX麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離。麥芽汁pH3.8或加有少量鏈霉素。于27℃培養(yǎng)48h后,用稀釋法分離,或培養(yǎng)3天至1周后,直接于麥芽汁平皿上劃線分離,挑取不同類型的菌落,純化。所分離菌種株與中國科學(xué)院微生物研究所的葡萄酒酵母AS2.374、AS2.612以及生香酵母AS2.300、AS2.470、AS2.1182等進(jìn)行對比測試。1.2.2.2.防疫性能1.2.2.2.1固酒性能將需測試的酵母細(xì)胞接入12°Bx的麥芽汁液體培養(yǎng)基中,27℃下培養(yǎng)96h后,經(jīng)蒸餾,用酒精比重計(jì)測酒精含量,比較其產(chǎn)酒力。1.2.2.耐二氧化碳能力的測定將需測試的酵母細(xì)胞接入分別含不同二氧化硫濃度培養(yǎng)基(含二氧化硫1.5~4kg/萬升溶液)的杜氏發(fā)酵管中,在27℃下培養(yǎng)48h,觀察其發(fā)酵情況,判斷其耐二氧化硫的能力。1.2.2.耐酒精能力的確定將需測試的酵母細(xì)胞接入分別含不同酒精濃度的麥芽汁培養(yǎng)基(含酒精12%vol~20%vol)的杜氏發(fā)酵管中,在27℃下培養(yǎng)48h至一周,根據(jù)發(fā)酵力,確定其耐酒精的能力。1.2.2.耐酸性能測定將需測試的酵母細(xì)胞接種于分別含不同濃度檸檬酸的麥芽汁培養(yǎng)基(含1~3.4g/100mL)杜氏發(fā)酵管中,在27℃下培養(yǎng)48h至一周,根據(jù)發(fā)酵力判斷菌株的耐酸性能。1.2.2.2.5產(chǎn)品范圍將需測試的酵母細(xì)胞接入含5%葡萄糖的12°BX麥芽汁培養(yǎng)基中,經(jīng)96h發(fā)酵后,用日本產(chǎn)GC-5A氣相色譜儀分析有關(guān)酯類。1.2.3生產(chǎn)工藝條件試驗(yàn)1.2.3.藍(lán)莓汁、藍(lán)莓汁和制備工藝的制備根據(jù)我們多年從事水果酒釀造的實(shí)際經(jīng)驗(yàn),確定藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝和浸制工藝試驗(yàn)方案如下:1.2.3.1.1藍(lán)莓→分選→破碎→藍(lán)莓果漿→組合酶酶解→滅酶→冷卻→分離→藍(lán)莓清汁→果漿成份調(diào)整→接釀酒1號酵母發(fā)酵→過濾→澄清處理→酯化→調(diào)配→過濾→包裝→成品1.2.3.1.2藍(lán)莓→分選→破碎→藍(lán)莓果漿→果漿成份調(diào)整→接釀酒1號酵母發(fā)酵→陳釀→澄清處理→調(diào)配→過濾→包裝→成品1.2.3.1.3藍(lán)莓→分選→破碎→藍(lán)莓果漿→加熱處理→冷卻→果漿成份調(diào)整→接釀酒1號酵母發(fā)酵→酯化→陳釀→調(diào)配→過濾→包裝→成品1.2.3.1.4藍(lán)莓→分選→破碎→藍(lán)莓果漿→組合酶酶解→滅酶→冷卻→分離→藍(lán)莓清汁→脫臭酒精浸制→浸制原酒→酯化→調(diào)配→過濾→包裝→成品1.2.3.1.5藍(lán)莓→分選→破碎→藍(lán)莓果漿→脫臭酒精浸制→浸制原酒→陳釀→調(diào)配→過濾→包裝→成品1.2.3.1.6藍(lán)莓→分選→破碎→藍(lán)莓果漿→加熱處理→冷卻→脫臭酒精浸制→浸制原酒→調(diào)配→過濾→包裝→成品2結(jié)果與討論2.1藍(lán)莓生物酶添加量的確定通過9種試驗(yàn),其組合酶的重量份確定為:果膠酶90%、纖維素酶5%、半纖維素酶5%、組合生物酶分解藍(lán)莓果的最佳用量為5/萬。酶解最佳溫度為45~50℃。2.2酵母菌的分離經(jīng)過對100多份黑加侖子與100多份黑加侖土壤及車間藍(lán)莓和黑加侖自然發(fā)酵液的分離,共分離得到185株酵母菌。在初步測試發(fā)酵力的基礎(chǔ)上,選擇了一株產(chǎn)酒較高的菌株(編號為釀酒1號),將釀酒1號菌與其他產(chǎn)酒與產(chǎn)酯酵母對比,結(jié)果如下:2.2.1葡萄酒酵母as26株酵母經(jīng)96h發(fā)酵后,所產(chǎn)酒精量以釀酒1號最高,產(chǎn)酒達(dá)5.1%vol;另二株葡萄酒酵母較低,其中AS2.1182為4.5%vol,AS2.374為3.7%vol。其他產(chǎn)酯酵母如AS2.300、AS2.470、AS2.1182雖能生香但產(chǎn)酒力很低,只達(dá)1.5%vol~2.0%vol,結(jié)果見表3。2.2.2發(fā)酵時(shí)間對so2發(fā)酵的影響6株酵母在含0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.04%的不同濃度SO2的培養(yǎng)基中,經(jīng)48h及一周發(fā)酵后,釀酒1號的耐SO2能力最高,在SO2濃度為0.04%時(shí)仍正常發(fā)酵,而AS2.374最差。其他幾株產(chǎn)酯酵母中以AS2.470、與AS2.300的耐SO2的能力較強(qiáng),其他則較差(表4)。2.2.3酒精培養(yǎng)基的發(fā)酵6株酵母在含12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol的酒精培養(yǎng)基中,經(jīng)48、96h發(fā)酵后,釀酒1號的耐酒精力最強(qiáng)。經(jīng)48h培養(yǎng)后,在含18%酒精的培養(yǎng)基中仍發(fā)酵較好。經(jīng)96h培養(yǎng)后在含20%酒精培養(yǎng)基中發(fā)酵也良好,而其他菌株則較差,結(jié)果見表5。2.2.4不同檸檬酸添加量的發(fā)酵6株酵母在含1%、1.8%、2.6%、3.4%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的不同濃度檸檬酸的培養(yǎng)基中,經(jīng)72h及1周培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)釀酒1號耐酸力最強(qiáng)。在含檸檬酸1.8%以下時(shí),經(jīng)培養(yǎng)48h后,發(fā)酵很旺盛,當(dāng)含檸檬酸3.4%時(shí),培養(yǎng)一周后,仍能發(fā)酵。而AS2.374在含酸2.6%以上就停止發(fā)酵。在產(chǎn)酯酵母中則以AS2.300的耐酸力好,結(jié)果見表6。2.2.5香味閥值的確定酵母菌對乙醇飲料所賦予的香味是由于不同的化合物形成的,不同化合物有不同的香味閥值,一般根據(jù)嗅覺也能初步判別。經(jīng)初篩認(rèn)為AS2.300的發(fā)酵液香味最濃,又經(jīng)過對三株酵母的發(fā)酵液所進(jìn)行的氣相色譜層析的比較分析,AS2.300產(chǎn)酯量較高,其中乙酸乙酯的量達(dá)69.9mg/100mL(表7)。2.3酒精1號發(fā)酵母菌的鑒定2.3.1培養(yǎng)基上細(xì)菌生長在麥芽汁培養(yǎng)基中,經(jīng)25℃培養(yǎng)3d后,細(xì)胞呈短橢圓形,細(xì)胞大小為(3.1~3.6)×(6~11.5)μm,培養(yǎng)一月后不形成醭。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上,25℃3d培養(yǎng)后細(xì)胞呈長橢圓形,多邊芽殖,細(xì)胞大小為(2.7~3.2)×(5.6~11)μm,培養(yǎng)1月后。細(xì)菌呈奶油色,表面較光滑。在克氏(Kleyn)生孢子培養(yǎng)基上,能形成子囊孢子。孢子橢圓形,不太規(guī)則,大小為(2.7~3.0)×(3.0~3.4)μm,每個(gè)子囊含1~3個(gè)子囊孢子,不形成假菌絲。2.3.2其他碳源、氮源與培養(yǎng)基釀酒1號能發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖與棉子糖,不發(fā)酵蜜二糖、乳糖。能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、松三糖、乙醇、甘油、山梨醇、α-甲基-葡萄糖苷、乳酸、檸檬酸、不同化所測的其它碳源,如L-山梨糖、纖維二糖、乳糖、蜜二糖、菊糖、可溶性淀粉、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖、L-鼠李糖、赤蘚醇、阿東糖醇、衛(wèi)矛醇、D-甘露醇、水楊甙、琥珀酸、檸檬酸、肌酸。在氮源方面不同化KNO3、鹽酸乙胺。在無維生素培養(yǎng)基上不生長,在100mg/L與1000mg/L放射線雙酮的培養(yǎng)基中不生長,不分解尿素與楊梅甙。根據(jù)上述形態(tài)與生理特征,釀酒1號定名為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。2.4藍(lán)莓酒生產(chǎn)和浸泡過程的確定和要點(diǎn)2.4.1酒發(fā)酵工藝和浸制工藝實(shí)驗(yàn)對比在藍(lán)莓酒傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝中,相當(dāng)長的時(shí)間為原酒陳釀過程,也就是原酒的澄清過程,一般經(jīng)過三年以上的原酒才能達(dá)到透明、晶亮,物理性能比較穩(wěn)定,釀造成的成品酒質(zhì)量才能穩(wěn)定,不會(huì)出現(xiàn)成品酒沉淀等質(zhì)量問題。通過我們對藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝和浸制工藝六種不同條件實(shí)驗(yàn)的對比(見表6),方案一和方案四制得的藍(lán)莓原酒達(dá)到了非常好的技術(shù)效果,從釀造時(shí)間看,方案四方法三個(gè)月和方案一方法六個(gè)月制造出來的原酒的澄清程度與傳統(tǒng)工藝方案二方法三年的澄清度還要好,而且果香味突出,出汁率也提高了近10%,新工藝方法是發(fā)酵和浸制之前,首先利用組合生物酶把果汁處理清,果汁澄清后,去掉了果酶質(zhì)、纖維素、多糖等物質(zhì)后再進(jìn)行人工酵用發(fā)酵和浸制,不僅提高了設(shè)備利用率,減少資金積壓,降低了生產(chǎn)成本,而且釀造出來的藍(lán)莓酒果香濃郁、綿長、清澈透明、營養(yǎng)豐富、口味純正、爽口。藍(lán)莓酒新工藝的研制成功,為紅酒的生產(chǎn)探索出了一條新的生產(chǎn)途徑,可用于紅葡萄酒、黑加侖酒、山楂酒、黑莓酒推廣應(yīng)用。2.4.2藍(lán)莓酒生產(chǎn)中的操作要點(diǎn)2.4.2.1、藍(lán)莓評分釀造藍(lán)莓酒用的藍(lán)莓果,要求果農(nóng)在采摘時(shí)即進(jìn)行分選,分選時(shí)主要是將霉壞粒分選出來,否則經(jīng)過封裝與運(yùn)輸就容易擴(kuò)大感染,對釀酒不利。2.4.2.2骨折在破碎時(shí),應(yīng)將藍(lán)莓果肉破碎率達(dá)到98%以上,以便在酶解過程中,通過生物酶的作用,使果肉與生物酶充分接觸,達(dá)到酶解效果。2.4.2.攪拌和酶解將破碎后的藍(lán)莓果漿泵入冷熱缸中有效容積的80%,迅速將藍(lán)莓果漿加熱至50℃,在加熱果漿的同時(shí),應(yīng)開啟攪拌器進(jìn)行攪拌,然后加入0.04%組合成生物酶制劑,在酶解過程中,要在密閉,恒溫,低速攪拌的容器中進(jìn)行,攪拌速度不益過高,否則會(huì)降低果汁澄清度,冷熱缸要有斷流裝置,不然果漿會(huì)隨攪拌器同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng),降低酶解效果。2.4.2.提高果汁質(zhì)量酶解后的果漿應(yīng)迅速加熱滅酶,酶被劇烈鈍化,使果漿有一個(gè)較理想的殘余黏度,提高果汁質(zhì)量,滅酶后,將果漿溫度降至25℃左右,再轉(zhuǎn)入浸制及發(fā)酵工序。2.4.2.性炭或樺活性炭脫干將食用酒精稀釋至75%vol左右,用活性炭或樺木炭等進(jìn)行脫臭處理,處理后的酒精微甜、純正、無辛辣味及異味。將冷卻后的生物酶解汁加入脫臭酒精制成浸泡原酒。2.4.2.發(fā)酵液發(fā)酵、發(fā)酵、過濾將滅酶冷卻后的酶解汁調(diào)整酒度,添加適量的二氧化硫,然后加入20%左右旺盛的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵,按最終生成15%vol計(jì)算補(bǔ)糖,控制發(fā)酵溫度在25℃左右,發(fā)酵時(shí)每天攪拌兩次,每次30min,當(dāng)殘?zhí)墙抵?.5%以下時(shí)停止發(fā)酵,過濾,為發(fā)酵原酒。2.4.2.發(fā)酵、酯化、溫度的確定為了使原酒盡快成熟、老化,產(chǎn)生較好酒香,可以將酒精浸泡原酒和發(fā)酵原酒分別泵入冷熱缸中進(jìn)行酯化,將原酒泵入冷熱缸中密閉,將罐內(nèi)溫度升至4