基于cf輸導(dǎo)法的蠶豆小葉脈ap酶和酸性磷酸酶的細胞化學(xué)定位

基于cf輸導(dǎo)法的蠶豆小葉脈ap酶和酸性磷酸酶的細胞化學(xué)定位

植物的小葉脈由韌皮部分子、木質(zhì)部分子、薄肉細胞和維管束鞘細胞組成，它們參與了事件的去除、收集、儲存和蒸發(fā)。ATP酶在生物體內(nèi)分布廣泛,可以催化ATP的水解,其與物質(zhì)的跨膜運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞內(nèi)物質(zhì)的合成與分解等代謝活動中能量的貯存和供應(yīng)密切相關(guān)(Serrano,1989)。以往的研究表明,ATP酶與韌皮部光合產(chǎn)物的運輸相關(guān)(GilderandCronshaw,1974;Cronshaw,1980;彭時堯等,1989;Parets-Soleretal.,1990;DeWittandSussman,1995;周竹青等,2009)。因此,關(guān)于庫區(qū)和源區(qū)ATP酶分布的研究對于揭示光合產(chǎn)物的運輸、裝載或卸出的機理是十分必要的。酸性磷酸酶(acidphosphatase)具有很多復(fù)雜的同工酶,在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)磷代謝的功能(ZhangandMcManus,2000)。對植物維管束不同細胞酸性磷酸酶的定位結(jié)果顯示,酸性磷酸酶可能與導(dǎo)管分子的分化以及同化物的運輸有關(guān)(LesterandEvert,1965;CharvatandEsau,1975;BentwoodandCronshaw,1976;StewartandPitt,1977;Evertetal.,1988;王雅清等,1999)。但在不同植物、不同發(fā)育階段及不同器官維管束的不同細胞中,ATP酶和酸性磷酸酶的定位結(jié)果有較大的差異。本研究以雙子葉植物蠶豆(Viciafaba)葉片為材料,采用CF(6(5)carboxyfluorescein)輸導(dǎo)方法確定庫源轉(zhuǎn)換葉片,然后再以該葉片的庫區(qū)、源區(qū)和幼嫩葉片的小葉脈為材料,采用鉛沉淀法對ATP酶和酸性磷酸酶進行細胞化學(xué)定位。實驗?zāi)康脑谟陉U明ATP酶和酸性磷酸酶在小葉脈不同發(fā)育階段的作用部位和動態(tài)變化,并為揭示小葉脈的結(jié)構(gòu)發(fā)育特征和植物同化物的運輸和分配方式提供重要依據(jù)。1材料和方法1.1發(fā)芽和生長花從市場上購得蠶豆(ViciafabaL.)用水浸泡24小時后,置于黑暗中發(fā)芽。發(fā)芽后移栽到花盆中,在HP400人工氣候箱中生長。培養(yǎng)條件:溫度為24/20°C(白天/夜間),光暗周期為12小時光照/12小時黑暗,白天光照強度為200μmol·m–2·s–1,相對濕度為60%–70%。1.2方法1.2.1molm-2s–1及輸導(dǎo)方法選取生長15天的蠶豆植株。先用少量0.3mol·L–1KOH溶液將CF溶解,然后加水至CF溶液的濃度為1mmol·L–1,最后用1mol·L–1HCl將pH值調(diào)至6.3。輸導(dǎo)時用細砂紙在蠶豆基部葉片表面磨出1個小圓圈(避開葉片主脈),用流水沖洗后,滴加30μLCF溶液于小棉球上置于摩擦處,罩上1層聚乙烯膜保濕,在24°C、光照強度為80μmol·m–2·s–1條件下輸導(dǎo)30分鐘至1小時。在LeicaMZ10F熒光體視鏡(B激發(fā))下觀察不同部位的葉片、同一葉片不同部位的熒光以確定庫源轉(zhuǎn)換葉片及其庫區(qū)和源區(qū)。1.2.2超聲輔助培養(yǎng)取生長5天植株的幼嫩葉片直接固定。成熟葉片經(jīng)CF輸導(dǎo)之后,將庫源轉(zhuǎn)換葉片的庫區(qū)和源區(qū)的葉片材料分別取材固定。用鋒利的刀片切取2–3mm2的葉片,先在4°C下用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液(用0.1mol·L–1、pH7.2二甲砷酸鈉緩沖液配制)固定4小時。固定后用0.1mol·L–1(pH7.2)二甲砷酸鈉緩沖液沖洗4次,每次15分鐘。之后進行孵育,孵育液配比為:0.05mol·L–1順丁烯二酸緩沖液(pH7.2),1.5mmol·L–1硝酸鉛,1mmol·L–1硫酸鎂,1mmol·L–1ATP。在37°C下孵育8小時。經(jīng)沖洗后于4°C下再用0.05mol·L–1(pH7.2)二甲砷酸鈉緩沖液配制的1%鋨酸固定液中固定2小時。之后進行系列乙醇脫水,經(jīng)環(huán)氧丙烷過渡和Spurr’s樹脂浸透后進行包埋。用LeicaUC7超薄切片機和鉆石刀進行超薄切片。切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,在JEM-1230透射電子顯微鏡下觀察和照相。設(shè)置對照:(1)孵育液中不加底物ATP;(2)孵育液中加入0.01mol·L–1NaF作為酶的抑制劑。1.2.3檢測主體的重新誘導(dǎo)流質(zhì)體系取材方法同1.2.2節(jié)所述。材料先用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛(用0.1mol·L–1、pH7.2二甲砷酸鈉緩沖液配制)固定液在4°C下固定4小時。用0.1mol·L–1(pH7.2)二甲砷酸鈉緩沖液沖洗后進行孵育,孵育液配比為:0.05mol·L–1順丁烯二酸緩沖液(pH5.2)、3.6mmol·L–1硝酸鉛,10mmol·L–1β-甘油磷酸鈉。在37°C保濕條件下孵育8小時。經(jīng)順丁烯二酸緩沖液沖洗后,4°C下再用0.05mol·L–1(pH7.2)二甲砷酸鈉緩沖液配制的1%鋨酸固定液中固定2小時。經(jīng)環(huán)氧丙烷過渡和Spurr’s樹脂浸透后進行包埋。超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,在JEM-1230透射電子顯微鏡下觀察并照相。分別設(shè)置在孵育液中不加底物β-甘油磷酸鈉和在孵育液中加入0.01mol·L–1NaF作為對照。2結(jié)果與討論2.1cf的熒光分布在生長15天蠶豆植株基部的源葉引入CF,輸導(dǎo)30分鐘至1小時,然后在熒光體視鏡下觀察植株所有葉片中CF的熒光分布狀況。圖1顯示在庫源轉(zhuǎn)換葉片中CF的熒光分布狀況。從圖1可以看出,庫源轉(zhuǎn)換葉片的葉上部熒光極弱,為葉片的源區(qū);而在葉片基部各級葉脈的網(wǎng)絡(luò)中均能觀察到很強的熒光,為葉片的庫區(qū)(圖1)。2.2胞間連絲中atp酶的標記蠶豆葉片小葉脈由薄壁細胞、木質(zhì)部分子、篩分子和傳遞細胞構(gòu)成(圖2A)。篩管伴胞的類型為傳遞細胞,屬于質(zhì)外體裝載類型(Bouché-Pillonetal.,1994)。在生長5天的蠶豆幼嫩葉片的小葉脈中,韌皮部傳遞細胞的細胞核、質(zhì)膜、液泡以及篩分子和傳遞細胞間的細胞壁和胞間連絲中有較多的ATP酶定位產(chǎn)物,但在篩分子中ATP酶的標記較弱(圖2B)。在韌皮薄壁細胞中,ATP酶定位于質(zhì)膜和細胞核(圖2C)。在分化中的木質(zhì)部分子的質(zhì)膜和細胞核上有較為強烈的ATP酶活性標記,但在分化接近成熟的木質(zhì)部分子上ATP酶活性顯著減弱(圖2D)。在成熟的木質(zhì)部分子中未見ATP酶活性標記(圖3A)。在庫源轉(zhuǎn)化葉片的庫區(qū),傳遞細胞和篩分子質(zhì)膜上的ATP酶活性標記較弱(圖3A)。在傳遞細胞的線粒體上ATP酶的標記較為強烈(圖3B)。韌皮薄壁細胞ATP酶的反應(yīng)產(chǎn)物主要存在于細胞核,在質(zhì)體上未見ATP酶的標記產(chǎn)物(圖3C)。在庫源轉(zhuǎn)換葉片的源區(qū),篩分子的質(zhì)膜以及傳遞細胞的質(zhì)膜及周圍的細胞質(zhì)中存在大量ATP酶的反應(yīng)產(chǎn)物,在篩分子與傳遞細胞之間的胞間連絲上也存在較強的ATP酶活性標記(圖3D)。在孵育液中不加反應(yīng)底物ATP或加入酶的抑制劑NaF的對照組幾乎沒有酶的反應(yīng)產(chǎn)物——鉛沉淀(圖5A)。2.3酸性磷酸酶的標記產(chǎn)物的增加生長5天的蠶豆幼嫩葉片的小葉脈在韌皮部的篩分子、傳遞細胞以及韌皮薄壁細胞的質(zhì)膜上存在較強的酸性磷酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物,另外在傳遞細胞和篩分子的細胞壁上也存在一定的酸性磷酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物(圖4A)。在分化中的木質(zhì)部分子的質(zhì)膜上存在大量的酸性磷酸酶活性產(chǎn)物,但在分化接近完成的木質(zhì)部分子中酸性磷酸酶的標記產(chǎn)物大為降低(圖4B)。在庫源轉(zhuǎn)化葉片的庫區(qū),篩分子的質(zhì)膜上酸性磷酸酶的標記很弱(圖4C),在傳遞細胞質(zhì)膜上存在少量的酸性磷酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物(圖4D)。在庫源轉(zhuǎn)換葉片的源區(qū),篩分子質(zhì)膜上有較為明顯的酸性磷酸酶的標記產(chǎn)物,在韌皮薄壁細胞與篩分子之間的胞間連絲上面有酸性磷酸酶的顯著標記(圖4E)。在傳遞細胞的質(zhì)膜及細胞核上存在大量的酸性磷酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物(圖4F)。在孵育液中不加反應(yīng)底物β-甘油磷酸鈉或加入酶的抑制劑NaF的對照幾乎沒有酶的反應(yīng)產(chǎn)物——鉛沉淀(圖5B)。2.4質(zhì)外體裝卸過程中atp酶活性的變化為了追蹤ATP酶和酸性磷酸酶在蠶豆葉片不同發(fā)育階段小葉脈不同細胞中的動態(tài)變化,在選材方面我們首先采用CF輸導(dǎo)方法確定蠶豆庫源轉(zhuǎn)換葉片,然后對庫源轉(zhuǎn)換葉的庫區(qū)、源區(qū)和生長5天植株幼嫩葉片的小葉脈進行酶的細胞化學(xué)定位。植物在生長發(fā)育過程中,其葉片經(jīng)歷一個由庫葉到源葉的變化。庫源的轉(zhuǎn)換是一個向基的過程,即從葉尖向葉基逐步進行。最初葉尖部先變?yōu)樵磪^(qū),然后逐漸向下擴展,最終整個葉片都變?yōu)樵雌鞴?Robertsetal.,1997)。CF是一種韌皮部輸導(dǎo)的示蹤劑。CF自大豆成熟葉片或成熟葉葉柄處引入,可在所有的庫器官檢測到CF發(fā)出的熒光,說明其輸導(dǎo)途徑和同化物一樣是從源到庫(Grignonetal.,1989)。Roberts等(1997)將Nicotianabenthaniana的葉脈分為I–V級,在庫葉CF主要從III級葉脈網(wǎng)絡(luò)卸載,在庫源轉(zhuǎn)換葉片的轉(zhuǎn)換區(qū)域CF不再自III級葉脈卸載。因此采用CF輸導(dǎo)法可以快速簡便地檢測到正在進行庫源轉(zhuǎn)換的葉片。Oparka等(1999)發(fā)現(xiàn)在煙草(Nicotianatabacum)庫源轉(zhuǎn)換葉的庫區(qū),胞間連絲以不分支的簡單形式存在,允許分子量為50kDa的GFP融合蛋白進行非選擇性的胞間轉(zhuǎn)移;而在源區(qū),大部分胞間連絲經(jīng)次生修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榫咧虚g腔的分支結(jié)構(gòu)形態(tài),胞間連絲的通透極限(sizeexclusionlimit)隨之降為1kDa。這說明在源區(qū)CF不能卸載是由于胞間連絲通透極限的下降。本實驗結(jié)果表明,在生長15天的蠶豆植株基部葉片引入CF,輸導(dǎo)之后在熒光體視鏡下觀察不同部位的葉片即可檢測到庫源轉(zhuǎn)換葉片。本實驗對蠶豆幼嫩葉片和庫源轉(zhuǎn)換葉片ATP酶的電鏡細胞化學(xué)定位結(jié)果表明,ATP酶的含量在蠶豆小葉脈不同細胞的不同發(fā)育階段存在動態(tài)變化。幼嫩葉片小葉脈不同細胞中較強的ATP酶含量可能與細胞分化發(fā)育過程中強烈的能量需求相關(guān)。在幼嫩葉片小葉脈傳遞細胞的質(zhì)膜上具有較為強烈的ATP酶活性標記。王新鼎(1993)觀察到在蠶豆種皮完整合點韌皮部的篩分子和傳遞細胞的質(zhì)膜上持續(xù)有較強的ATP酶標記產(chǎn)物,顯示ATP酶參與庫器官有機物的質(zhì)外體卸出。蠶豆庫源轉(zhuǎn)化葉片的庫區(qū)篩分子和傳遞細胞的質(zhì)膜上ATP酶的標記較弱,說明庫區(qū)在向源區(qū)轉(zhuǎn)換的過程中,有機物的質(zhì)外體卸出作用逐漸減弱。蠶豆庫源轉(zhuǎn)換葉片的源區(qū)篩分子和傳遞細胞的質(zhì)膜及周圍的細胞質(zhì)中存在大量的ATP酶活性產(chǎn)物,提示ATP酶參與光合同化物裝載的生理過程。植物細胞質(zhì)膜上具有H+-ATP酶和Ca2+-ATP酶(Chengetal.,2000)。質(zhì)膜上的H+-ATP酶在質(zhì)膜細胞質(zhì)一側(cè)水解ATP產(chǎn)生能量將細胞質(zhì)中的H+泵到細胞膜外,形成跨膜H+梯度,產(chǎn)生細胞膜兩側(cè)H+的電化學(xué)勢,為溶質(zhì)的次級跨膜轉(zhuǎn)運提供驅(qū)動力。因此,H+-ATP酶在同化物的質(zhì)外體裝載過程中具有重要的作用(MicheletandBoutry,1995)。生理學(xué)實驗結(jié)果表明,蠶豆葉組織中的質(zhì)子流動與糖的攝取有關(guān)(Delrot,1981)。Parets-Soler等(1990)采用質(zhì)膜H+-ATP酶的抗體對其在燕麥(Avenasativa)和豌豆(Pisumsativum)中的分布進行了組織學(xué)水平的免疫定位,發(fā)現(xiàn)在葉和莖中H+-ATP酶集中定位于韌皮部。他們認為H+-ATP酶可以為同化物裝載提供驅(qū)動力。Bouché-Pillon等(1994)對蠶豆小葉脈進行了質(zhì)膜H+-ATP酶的免疫定位,發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜H+-ATP酶的活性在不同的細胞類型中差異較大。傳遞細胞質(zhì)膜H+-ATP酶的活性高于其它類型的細胞,為韌皮部質(zhì)外體裝載以及篩管對含氮化合物的質(zhì)外體吸收提供能量來源。蠶豆篩管的伴胞類型為傳遞細胞,內(nèi)含大量的線粒體,其細胞壁內(nèi)陷使質(zhì)膜表面積增大,在源區(qū)韌皮部對光合同化產(chǎn)物的質(zhì)外體裝載起著非常重要的作用(Kempersetal.,1998)。本實驗結(jié)果表明,在庫源轉(zhuǎn)換葉的庫區(qū)ATP酶的標記較弱;但在庫源轉(zhuǎn)換葉的源區(qū)ATP酶在傳遞細胞和篩分子質(zhì)膜上的標記顯著增強,參與源區(qū)同化物的裝載。該結(jié)果為蠶豆光合產(chǎn)物的質(zhì)外體裝載理論提供了新的實驗依據(jù)。在杜仲(Eucommiaulmoides)木質(zhì)部細胞分化和脫分化過程中,ATP酶在細胞內(nèi)的分布呈動態(tài)變化(王雅清等,2000)。本實驗結(jié)果表明,在蠶豆分化中的木質(zhì)部分子的質(zhì)膜和細胞核有較為強烈的ATP酶標記產(chǎn)物;在分化接近成熟的木質(zhì)部分子ATP酶的標記產(chǎn)物顯著減少;在成熟的木質(zhì)部分子中未見ATP酶標記產(chǎn)物。說明ATP酶參與木質(zhì)部分子的分化過程,可能為木質(zhì)部分子原生質(zhì)的降解提供能量。有一些實驗證據(jù)顯示,酸性磷酸酶與植物體內(nèi)同化物的運輸相關(guān)。在煙草葉片的中脈酸性磷酸酶定位于成熟篩管的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和P-蛋白上(BentwoodandCronshaw,1976)。在椴樹(Tiliaamericana)次生韌皮部的伴胞、薄壁細胞以及篩管的聯(lián)絡(luò)索(internalstrands)中檢測到酸性磷酸酶活性,伴胞和薄壁細胞中的酸性磷酸酶可能參與韌皮部物質(zhì)的運輸(LesterandEvert,1965)。玉米(Zeamays)葉片維管束中薄壁篩管(thin-walledsievetubes)的質(zhì)膜上有較強的酸性磷酸酶標記;而在厚壁篩管(thick-walledsievetubes)的質(zhì)膜上酸性磷酸酶的標記較弱。薄壁篩管具有從質(zhì)外體獲取蔗糖的能力(Evertetal.,1988)。本實驗中酸性磷酸酶的細胞化學(xué)定位結(jié)果顯示,在篩分子、傳遞細胞質(zhì)膜和細胞壁上酸性磷酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物多見于發(fā)育早期的小葉脈,此時期韌皮部的酸性磷酸酶可能參與細胞壁的代謝,與篩分子的發(fā)育相關(guān)。從源庫轉(zhuǎn)換葉的庫區(qū)到源區(qū),篩分子、傳遞細胞質(zhì)膜上酸性磷酸酶的標記產(chǎn)物由弱變強。這種動態(tài)變化說明酸性磷酸酶可能在源區(qū)光合產(chǎn)物的裝載中起一定的作用,但具體機理需要進一步研究。以往的研究表明酸性磷酸酶定