Clustalx-實驗指南(一步一步很詳細)

實驗三：多條序列比對——Clustalx（一）ClustalXClustal是一種利用漸近法（progressivealignment）進行多條序列比對的軟件。即從多條序列中最相似（距離最近）的兩條序列開始比對，按照各個序列在進化樹上的位置，由近及遠的將其它序列依次加入到最終的比對結(jié)果。（Figure3.1）HYPERLINK/安裝clustalx程序。雙擊安裝clustalx-2.0.12.exe文件到自己的電腦上。也可從HYPERLINK下載，列表中的倒數(shù)第二個文件。2Figureclustal算法準備要比對的序列請查找至少存在于5個物種中的同源序列（核酸或蛋白質(zhì)皆可），并保存為fasta格式，存為文本文件（所有的序列請粘貼到同一個文本文件中）。選擇NM、XM或NP打頭的序列，不要選擇NC或NW打頭的序列，那是全基因組序列。做法可參照郵箱中的preparationsforpractice3.doc文件。打開clustalX程序開始菜單－程序－clustalX2-clustalX2載入序列點最上方的File菜單，選擇LoadSequence-選擇你剛保存的序列文件，點打開。在左側(cè)窗口里是fasta格式序列的標識號，取自序列第一行“>”后的字符。(Figure)注意：ClustalX程序無法識別漢字，無法識別帶空位的文件夾名，如mydocument。各位同學保存的序列文件不要保存在桌面上或帶漢字的文件夾中，推薦保存在D盤根目錄下。常見文件打開錯誤原因：序列格式有問題，非正確的fasta格式。文件中有序列重復粘貼。TIPS:想要方便識別序列所屬物種，可在每條序列“>”后輸入物種名，加空位即可。EXAMPLE：原格式：>gi|262050536|ref|NM_002218.4|Homosapiensinter-alpha(globulin)inhibitorH4(plasmaKallikrein-sensitiveglycoprotein)(ITIH4),transcriptvariant1,mRNA改為：>humangi|262050536|ref|NM_002218.4|Homosapiensinter-alpha(globulin)inhibitorH4(plasmaKallikrein-sensitiveglycoprotein)(ITIH4),transcriptvariant1,mRNAFigure載入序列比對參數(shù)的選擇可以對兩條序列比對的參數(shù)和多條序列比對的參數(shù)進行設(shè)置。兩條序列比對的參數(shù)設(shè)置點擊Alilgnment菜單，選擇AlignmentParameters,再選擇PairwiseAlignmentParameters,得到Figure.首先可以選擇比對的效果，是slow/accurate還是fast/approximate。第一種模式采用的是動態(tài)規(guī)劃算法進行比對的，第二種模式采用的是啟發(fā)式的算法。除非序列非常長，一般采用第一種模式?？梢赃x擇空位罰分系統(tǒng)，要使用的DNA或蛋白質(zhì)替換矩陣，也可以自己上傳某個替換矩陣進行比對。FigurePairwiseAlignmentParameters多條序列比對參數(shù)設(shè)置點擊Alilgnment菜單，選擇AlignmentParameters,再選擇MultipleAlignmentParameters,得到Figure.FigureMultipleAlignmentParametersDelaydivergentsequence是指當兩條序列的差異大于某個值（百分比）的時候，這兩條序列的比對將推遲進行，它們的比對結(jié)果會在最后加入到最終的多條序列比對結(jié)果。DNAtransitionWeight等于0的時候，程序?qū)⑥D(zhuǎn)換（transition）當作錯配(mismatch)看待，等于1的時候，將轉(zhuǎn)換(transition)當作顛換(transversion)看待。當參與比對的序列差異較大時，DNAtransitionWeight應該選擇的小些（接近0），如果參與比對的序列差異較小時，DNAtransitionWeight可選擇的大些（接近1）。更改輸出格式點擊Alignment菜單，選擇OutputFormatOptions，頁面如Figure。默認的是輸出clustalformat,如果需要其它格式，可在復選框里打勾。PHYLIP格式是利用PHYLIP軟件進行建樹時，需要輸入的格式,我們將在實驗6系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建中用到。Figure輸出格式選項進行比對點擊Aliglnment菜單，選擇DoCompleteAlignment.此時出現(xiàn)一個對話框，提示你比對結(jié)果保存的位置，你在上一步選擇了多少種輸出格式，這里就會給出多少個文件的路徑。選擇好了點OK即可。要得到理想的比對結(jié)果，你可能需要選擇不同的參數(shù)，進行多次比對，最后再對各種比對結(jié)果進行分析，選擇哪個是最合理的結(jié)果（theresultmakingbiologicalsense）。比對結(jié)束后生成的aln文件是多條序列比對的結(jié)果，可以用記事本打開瀏覽(Figure)。在某一列比對結(jié)果下方如果出現(xiàn)*，說明這列是完全匹配。dnd文件是比對過程中生成的進化樹，可以用treeview（壓縮包中的treev32.rar文件）打開瀏覽(Figure)。Figure記事本打開生成的aln文件FigureTreeview打開dnd文件迭代比對如果序列比對結(jié)果不理想，可以采用迭代選項，多次迭代尋找最佳比對結(jié)果。點擊Alignment菜單，選擇iteration,選擇iterateeachalignmentstep或iteratefinalalignment.然后再點擊Aliglnment菜單，選擇DoCompleteAlignment進行比對。概型（Profile）比對模式以上介紹的都是MultiplealignmentMode，ClustalX還提供了一個概型比對模式，在菜單欄下方選擇ProfileAlignmentMode,可以對兩個比對結(jié)果（alignment,termedprofilehere）進行再比對，或?qū)⒁粭l序列與一個比對結(jié)果（profile）進行比對。（Figure）還可以利用二級結(jié)構(gòu)信息指導多條序列比對。FigureProfileAlignmentMode（二）TreeviewClustalx產(chǎn)生的guidetree(即后綴為dnd文件)，可以通過treeview軟件瀏覽。解壓縮并安裝文件。雙擊后綴為dnd文件，選擇treeview程序打開即可。其它不詳之處請參考clustalx_help.html或clustalx.pdf兩個文件。作業(yè)：Clustalx是多條序列比對軟件，為什么